腰带长体茧蜂化学感受基因的克隆、表达及功能研究

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腰带长体茧蜂Macrocentrus cingulum在欧洲及日本、韩国和中国等亚洲国家中被广泛用于防治鳞翅目秆野螟属Ostrinia昆虫。气味结合蛋白(OBPs)在昆虫气味识别过程中能够识别、结合和溶解气味分子,并且在触角感器内运输气味分子通过淋巴液到受体上,进而引发行为反应。同时,昆虫嗅觉受体(ORs)、离子受体(IRs)和一些味觉受体(GRs)在感受神经元反应中也参与了信号转导途径。主要结论如下:本文主要是研究腰带长体茧蜂的嗅觉识别的分子机制,从而尽力拓展对化学感受途径的理解。因此本研究利用第二代测序技术完成了腰带长体茧蜂雌雄虫触角转录组的测序,并且鉴定了 129个嗅觉相关基因。其中包括9个OBPs,8个CSPs,79个ORs,20个GRs,13个IRs,并且通过RT-PCR分析了这些基因的表达水平。利用qPCR技术分析了 GR在嗅觉组织和非嗅觉组织中的表达水平。嗅觉受体的特异性表达表明它们在气味分子的识别过程中发挥着重要的作用。本文也为腰带长体茧蜂在化合物识别过程中,由分子水平到行为研究的发展提供了全面的基础。基于蛋白热稳定性,我们研究了 McinOBP2,McinOBP3及其突变体(缺少第三个二硫键)的结合能力。荧光定量PCR结果表明McinOBP2和McinOBP3主要在成虫触角中表达,并且雌雄虫表达中有差异。基于蛋白与气味分子结合过程中的热稳定性的变化,我们利用圆二色谱研究了 McinOBP2,McinOBP3及其突变体与醛类、萜烯类和脂肪族化合物的结合能力,结果显示McinOBP2和McinOBP3及其突变体与trans-葎草烯、法尼烯和叶醇都有较强的结合能力。由于突变体构象及结合腔的形状的变化,突变体和野生型蛋白的结合能力也存在差异。结果表明突变体蛋白缺少第三个二硫键可能引发错误的折叠方式,进而引发与气味分子结合能力的降低。本研究发现典型气味结合蛋白McinOBP4与玉米叶片挥发物有很好的结合能力,荧光定量PCR显示McinOBP4主要在腰带长体茧蜂的触角中表达,并且雌雄中表达有差异。荧光竞争结合实验表明McinOBP4对萜烯类、脂肪醇类和醛类有很好的结合能力。我们同时测定了突变体M1(缺乏最后8个氨基酸)和M2(Met119突变为亮氨酸)的结合能力。在酸性条件下,1-NPN同McinOBP4和M1的结合能力大幅度下降,而在中性条件下没有显著差异。C端缺乏表现出与萜烯类、脂肪醇和醛类气味分子结合能力的下降。最后,荧光竞争结合实验表明M2与所测试的气味分子的结合能力显著下降。表明Met119与气味分子在识别过程中形成氢键。这些研究结果为研究McinOBP4的功能提供了新的视角,并且有助于提高生态友好型昆虫防治战略的发展。
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