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研究背景和目的:肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是一种死亡率高的原发性肝癌,在全球范围内高发,尤其是亚洲,非洲和南部欧洲,在我国,肝细胞癌的发病人数几乎占到全球发病人数的一半。肝细胞癌发病隐匿,早期症状不明显,等出现症状时多已到中晚期,或伴远处转移。此时手术治疗效果不理想,导致患者很快死亡。因此,阐明肝癌的转移机制,对肝癌的早期发现及治疗有十分重要的意义。本文对肝细胞癌的转移机制进行研究,旨在发现介导肝细胞癌转移的关键分子,为肝细胞癌的治疗提供新的靶点。HMGA2（high mobility group AT-hook2）是高迁移率蛋白（high mobility group,HMG）家族成员之一,此外,HMGA1（high mobility group AT-hook1）也是该家族的一员。HMGA1是一种结构性转录因子,通过与其他转录因子结合,协同调控下游靶基因的转录。研究发现,HMGA1在多种肿瘤组织（肝癌、乳腺癌、胰腺癌、皮肤癌等）中表达水平显著上调,并且可以通过调节多种靶基因的转录,促进肿瘤的增殖和转移。HMGA2蛋白主要定位于细胞核中,虽然没有转录活性,但它可以通过改变染色质的结构来调控下游基因的转录。近年来的研究表明,HMGA2蛋白在口腔癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、结肠癌和食管癌等多种肿瘤组织中异常增高,且与这些肿瘤的转移以及不良预后相关,但是,HMGA2在肝癌中的表达情况及其在肝癌进展中的作用研究较少。因此本课题在研读文献的基础上,研究HMGA2在肝癌转移和增殖中的作用,并探讨其相关分子机制,探索其作为肝癌治疗新靶点的潜力。第一部分:HMGA2促进肝癌转移目的通过动物模型和细胞功能研究分析HMGA2在肝癌发生发展中的作用。方法1)采用DEN构建大鼠肝癌模型,RT-PCR和Western Blot实验检测大鼠肝脏中HMGA2 mRNA和蛋白的表达。2)将HMGA2过表达质粒及其对照质粒转染至HMGA2低表达的HepG2细胞,将HMGA2shRNA及其对照质粒转染至HMGA2高表达的MHCC-97H细胞,采用MTT实验检测肝癌细胞的增殖能力,划痕实验和Transwell实验检测肝癌细胞的迁移能力,Transwell铺Matrigel胶实验检测肝癌细胞的侵袭能力。3)构建裸鼠皮下移植瘤和肺转移模型,并分析HMGA2介导的基因工程细胞在肝癌增殖和转移中的作用。结果1)通过免疫组化实验发现,我们成功构建了大鼠肝癌模型;同时通过RT-PCR和Western Blot检测发现,DEN诱导组大鼠肝脏组织中HMGA2 mRNA和蛋白的表达明显高于对照组（P<0.01）。2)MTT,细胞划痕及Transwell实验结果表明,HepG2细胞过表达HMGA2基因后,增强了 HepG2细胞的迁移和侵袭能力（P<0.05）;MHCC-97H细胞敲降HMGA2基因后,MHCC-97H细胞的迁移和侵袭能力显著降低（P<0.05）。3)裸鼠皮下移植瘤的实验结果发现,过表达或敲降HMGA2基因后,对裸鼠皮下移植瘤的增殖没有显著影响。经尾静脉注射实验发现接种HepG2-HMGA2细胞的裸鼠肺部出现的结节数明显较对照组多（P<0.05）,而接种MHCC-97H-shHMGA2细胞的小鼠肺部结节数明显少于对照组（P<0.01）。结论通过肝癌动物模型及细胞功能实验显示:HMGA2能够促进肝癌细胞的转移,但对肝癌细胞的增殖没有影响。第二部分:EGFR的激活促进肝癌中HMGA2的表达目的EGFR是否为激活肝癌中HMGA2表达的上游调控基因方法1)采用ELISA法检测对照组和DEN诱导肝癌模型组大鼠血液中EGF的水平;Western Blot技术检测大鼠肝癌模型的肝脏组织中EGFR的表达及p-EGFR的水平。2)采用RT-PCR和Western Blot技术检测外源添加EGF及EGFR抑制剂后肝癌细胞中HMGA2的表达。3)采用RT-PCR和Western Blot技术检测在JAK抑制剂、ERK抑制剂和PI3K抑制剂作用下肝癌细胞中HMGA2的表达。4)通过Transwell小室实验检测在外源EGF及ERK通路抑制剂的作用下,HepG2和MHCC-97H细胞的迁移与侵袭能力。结果1)与溶剂组、空白对照组大鼠相比,肝癌模型组大鼠血浆中EGF的含量明显上调（P<0.01）;大鼠模型肝脏组织中EGFR的表达也明显上调（P<0.01）;p1068-EGFR的表达也明显较溶剂组和空白对照组多（P<0.01）。2)外源EGF孵育可以显著提高HepG2细胞和MHCC-97H细胞中HMGA2 mRNA和蛋白的表达;而EGFR酪氨酸蛋白酶抑制剂Gefitinib可显著抑制EGF诱导的HMGA2 mRNA和蛋白表达的上调（P<0.01）。3)通过添加3种抑制剂（JAK抑制剂AG490、ERK抑制剂PD98059和PI3K抑制剂LY294002）对EGFR调控HMGA2的研究发现,在肝癌细胞HepG2和MHCC-97H中,仅有ERK抑制剂PD98059能够明显抑制EGF诱导的HMGA2 mRNA和蛋白表达的上调（P<0.01）。4)Transwell小室实验发现与仅添加EGF相比,添加外源ERK通路抑制剂PD98059后,EGF诱导的HepG2和MHCC-97H细胞的迁移与侵袭能力均显著下降（P<0.01）。结论EGFR可以通过MEK-ERK通路调控肝癌细胞中HMGA2的表达。第三部分:MEK/ERK通过磷酸化ELK1调控肝癌中HMGA2的表达目的研究ERK/ELK-1是否参与了 EGFR诱导的HMGA2的表达。方法1)Western Blot技术检测EGFR对ELK1丝氨酸383位点磷酸化的影响。2)RT-PCR技术和Western Blot技术研究ELK1敲降及其Ser 383位点突变对HMGA2的转录调控作用。3)双荧光素酶实验和染色质免疫共沉淀实验分析肝癌细胞系中ELK1对HMGA2的启动子区的结合。结果1)Western Blot实验发现EGF孵育后,HepG2和MHCC-97H细胞中ELK1磷酸化蛋白水平明显上调,但ELK1总蛋白量没有显著变化,其中ELK1的核移位增加;EGFR酪氨酸蛋白酶抑制剂Gefitinib和MEK/ERK通路抑制剂PD98059可以明显抑制EGFR诱导的ELK1丝氨酸383位点的磷酸化;同时大鼠肝癌模型中肝脏组织ERK1/2总蛋白,磷酸化蛋白及ELK1磷酸化蛋白的水平与细胞实验完全一致,提示EGF是通过与EGFR结合,激活MEK/ERK信号通路来诱导ELK1的磷酸化。2)ELK1基因敲减后,EGF孵育HepG2和MHCC-97H细胞,HMGA2的mRNA以及蛋白的表达明显下调;对ELK1的Ser 383位点进行突变并转染到HepG2和MHCC-97H细胞,HMGA2的mRNA和蛋白的表达明显高于空载体pcDNA3.1 组、ELK1 WT 组、ELK1 S383A 组,证明 ELK1 的 Ser 383 位点的磷酸化参与了 HMGA2的表达调控。3)双荧光素酶结果表明 p-1958-HMGA2-Luc、p-1247-HMGA2-Luc、p-867-HMGA2-Luc组与转染p-GL3 basic组质粒相比均具有较高的荧光素酶活性,而p-132-HMGA2-Luc组的荧光素酶活性与上述三组相比则明显减弱;进一步通过免疫共沉淀发现HepG2和MHCC-97H细胞在EGF孵育后HMGA2启动子区域ELK1的水平显著上调,以上结果证明HMGA2启动子区域上游217-221位点是可能是ELK1的结合位点。结论EGFR通过诱导ELK1丝氨酸383位点磷酸化并参与调控HMGA2的转录与表达。