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研究背景Wnt信号通路持续激活参与了肿瘤干细胞特性的维持,是卵巢上皮癌复发及化疗耐药的关键机制之一。LGR6是富含亮氨酸的G蛋白偶联受体,被认为参与了经典Wnt信号通路的激活;但在卵巢上皮癌中,LGR6的临床意义、生物学功能以及其对Wnt信号通路的调控尚未阐明。研究目的探讨LGR6在卵巢上皮癌组织中表达的临床意义;LGR6在卵巢上皮癌细胞中对肿瘤干细胞样特性维持、对化疗药物敏感性的影响,以及在此过程中LGR6对Wnt经典信号通路的影响。研究方法1.用实时荧光定量PCR、免疫蛋白印迹、免疫组织化学等方法检测LGR6在卵巢上皮癌组织中的表达,分析294例卵巢上皮癌临床样品中LGR6的表达与化疗疗效、生存预后的关系。2.通过siRNA建立稳定的LGR6低表达卵巢上皮癌细胞株,构建卵巢癌细胞模型,用无血清悬球培养法、流式细胞术分析侧群细胞比例、荧光定量PCR检测干细胞分子标记等方法,验证LGR6在诱导和维持肿瘤干细胞特性中的作用。3.在卵巢上皮癌细胞模型中用CCK-8法、AnnexinV-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡、JC-1法测定线粒体膜电位、Caspase-9/-3底物活性测定法和免疫蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白与基因的表达活性等方法,观察各组卵巢上皮癌细胞对顺铂、紫杉醇的敏感性;在卵巢上皮癌细胞裸鼠皮下移植成瘤模型中,观察沉默LGR6对卵巢上皮癌细胞在体内对顺铂疗效的影响。4.通过用免疫蛋白印迹法分析卵巢上皮癌细胞模型中β-catenin的入核情况、双荧光素酶报告基因检测系统检测TCF转录活性、荧光定量PCR法检测Wnt通路下游基因表达,探讨在卵巢上皮癌细胞中LGR6对经典Wnt通路激活的影响。在沉默了 LGR6基因的卵巢上皮癌细胞中回补C33Y突变的β-catenin,验证经典Wnt信号通路参与了 LGR6对卵巢上皮癌细胞肿瘤干细胞特性的维持和化疗敏感性的影响。研究结果1.LGR6在卵巢上皮癌组织中表达上调,其高表达与病理类型相关,与卵巢上皮癌临床病例的FIGO分期、化疗疗效不佳呈正相关,与总生存率、无进展生存率负相关。2.沉默LGR6可抑制卵巢上皮癌细胞的肿瘤干细胞特性;改善其在体外、体内对顺铂、紫杉醇等化疗药物的敏感性。3.沉默LGR6能抑制Wnt经典信号通路,并介导了其对卵巢上皮癌细胞的干细胞特性和化疗敏感性的影响。研究结论LGR6可作为预测卵巢上皮癌患者化疗疗效及不良预后的潜在标记物;LGR6通过激活经典Wnt信号通路维持卵巢癌细胞“干样”特性,沉默LGR6可改善卵巢上皮癌细胞对化疗药物的抗药性。LGR6可能是卵巢上皮癌潜在的治疗靶点。