[研究背景]目前,结肠癌是我国最常见的消化道恶性肿瘤之一,年发病率高达59/10万,五年生存率约为32%。寻找有效的预防控制和治疗结肠癌的方法是当务之急,目前基因治疗是肿瘤治疗的一个重要研究方向。受诸多因素影响,基因治疗效果并不十分理想。一方面,引起肿瘤发生的机制非常复杂,难以确定特异性的靶向基因。 目前研究普遍认为,细胞凋亡障碍是肿瘤发生的重要机制,诱导肿瘤细胞凋亡是成功治疗肿瘤的关键因素之一。研究表明Bag-1基因是重要的肿瘤凋亡抑制基因,其突变是结肠癌发生的重要遗传基础,也是各种因素导致结肠癌发生过程的关键环节。因此,将Bag-1基因为靶基因,运用小干扰RNA技术特异性阻断Bag-1基因表达,用于结肠癌的基因治疗,可能获得一种新的结肠癌治疗的有效方法。另一方面,基因治疗受到基因传递系统的限制,以病毒为主的基因载体存在较大安全隐患；而非病毒磁性纳米基因载体具有低毒低免疫性,是具有巨大潜力的新型基因载体。通过制备新型有效的纳米基因载体搭载特异性阻断Bag-1基因RNAi重组质粒,进行体内外实验研究探讨其对结肠癌治疗的疗效和机制,对进一步明确结肠癌发生发展的机制,建立一种新型有效的结肠癌基因治疗方法具有重要的意义。[目的]制备一种新型复合磁性金纳米基因载体,并研究其介导RNAi重组质粒沉默Bag-1基因后对结肠癌的治疗及作用机制。[方法]1.采用化学共沉淀法及分子表面修饰技术制备功能性复合磁性金纳米微粒(PEG/Fe3O4@Au),检测其表征特性,并对其作为基因载体的性能进行测试。2.采用细菌培养的方法扩增并提取Bag-1基因RNAi重组质粒(pGPH1/GFP/ Neo-Bag-1-homo-825),将RNAi质粒与磁性金纳米微粒进行孵育,制备出载基因磁性金纳米细胞转染体系。3.噻唑蓝(MTT)法检测磁性金纳米微粒对不同结肠癌细胞系(LoVo, HCT116)及正常结肠组织细胞系(FHC)的毒性,并选取Lipofectamine 2000基因载体作为对照进行实验。4.载基因磁性金纳米转染LoVo细胞系,荧光显微镜下观察细胞转染情况,流式细胞仪检测细胞转染效率及细胞凋亡率；实时荧光定量PCR (RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)法检测LoVo细胞中Bag-1基因在mRNA和蛋白水平的改变。5.皮下注射细胞活性高的单纯LoVo细胞构建Balb c/nud裸鼠移植瘤模型,模型构建成功后随机分成五组,每三天分别对相应组小鼠原位注射相同体积的生理盐水,质粒,磁性金纳米,载基因磁性金纳米和载基因磁性金纳米(外加磁场组),并记录各组肿瘤瘤体生长大小。四周后处死小鼠分别取各组瘤体组织,每份瘤体组织分别用4%的多聚甲醛固定组织及液氮处理后-80℃条件下直接保存新鲜瘤体组织。6.HE染色法观察不同组瘤体组织形态学改变；免疫组化(1HC)法检测不同组瘤体组织中Bag-1基因及肿瘤相关C-myc, β-catenin基因的表达情况。7. RT-PCR和Western blot法检测不同组瘤体组织中Bag-1基因及肿瘤相关C-myc, β-catenin基因在mRNA和蛋白水平的表达情况。[结果]1.制备功能性复合磁性金纳米微粒(PEG/Fe3O4@Au)在透射下呈大小约100nm左右圆形颗粒,分布较均匀。激光光散射粒度分析仪检测结果显示纳米微粒大小约为(95.38±7.16)nm, zeta电位为(35.03±3.12)mV,能够装载并释放质粒DNA。2.经验证扩增并提取出的质粒为所构建的Bag-1基因RNAi重组质粒(pGPH1/GFP/Neo-Bag-1-homo-825),与磁性金纳米微粒孵育后,制备出性质较稳定的载基因磁性金纳米转染体系,可用于细胞转染。3.磁性金纳米微粒对细胞系LoVo,HCT116及FHC细胞基本无毒性,其性质与Lipofectamine2000转染试剂相似,载质粒磁性金纳米微粒能较明显地抑制人结肠癌细胞的活性而对人正常结肠组织细胞活性无明显影响。4.载基因磁性金纳米微粒成功转入LoVo细胞,导入的外源基因在细胞内顺利表达。流式细胞分析结果显示,载基因磁性金纳米微粒细胞转染效率约为22%。相比磁性金纳米转染组,质粒转染组以及对照组相比,载基因磁性金纳米转染组的细胞凋亡率明显升高(P<0.05),而其余三组间细胞凋亡率差异无统计学意义。RT-PCR和Western blot实验结果显示载基因磁性金纳米实验组Bag-1基因在mRNA(P<0.05)和蛋白水平(P<0.05)的表达都明显下降。5.裸鼠移植瘤瘤体在大小约5mm左右时开始给予各组处理,四周后载基因磁性金纳米组及载基因磁性金纳米外加磁场组裸鼠移植瘤大小明显小于其他三组(P<0.05)。6.光镜下观察各组瘤体组织HE染色结果并未发现显著性差异,但IHC结果显示载基因磁性金纳米组及载基因磁性金纳米外加磁场组裸鼠移植瘤组织Bag-1基因及肿瘤相关C-myc, P-catenin基因的表达明显下调,但其两者间并无明显差异。7. RT-PCR和Western blot法检测结果显示载基因磁性金纳米组及载基因磁性金纳米外加磁场组裸鼠移植瘤组织Bag-1基因在mRNA水平(P<0.05)和蛋白水平(P<0.05)的明显低于其他三组,但这两组组间差异不具有统计学意义。进一步实验研究表明肿瘤相关C-myc,β-catenin基因,同时也是Wnt/β-catenin信号通路重要分子,随着Bag-1基因的抑制下调,其表达也相应下降。[结论]复合磁性金纳米基因载体制备相对简易,成本低,细胞毒性小,作为基因载体具有一定优越性。本实验中磁性金纳米载体介导Bag-1基因RNAi重组质粒成功转入人结肠癌LoVo细胞,导入的外源基因在细胞内顺利表达表达。体内外实验进一步证实Bag-1基因是一种抗凋亡基因与结肠癌发生发展及转归有着密切的联系。实验还提示Bag-1基因与结肠癌发生发展的机制可能与Wnt/β-catenin信号通路异常相关。本实验成功制备了一种新型磁性金纳米基因载体,其介导的RNAi重组质粒沉默Bag-1基因治疗结肠癌的方法是一种有效的肿瘤基因治疗方法。