论文部分内容阅读
背景:胆管癌(Cholangiocarcinoma,CCA)是威胁人类健康的重大疾病之一,发病率逐年升高,并且早期诊断困难,初次就诊患者手术率低于30%;胆管癌根治术后5年内生存率小于10%。目前,治疗胆管癌的方法不是太多,胆管癌患者的总体预后很差。胆管癌高发于40岁以上的人群,男性的发病率略高于女性,胆管癌威胁着人类的生命,给家庭、社会和国家造成很大的经济及精神负担。因此,寻找新的胆管癌治疗方法是目前面临的当务之急。侵袭转移是胆管癌致死的主要原因。上皮间叶样转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是促进胆管癌细胞侵袭转移能力的重要现象。而锌指转录因子(zinc-finger transcription factor,SNAIL)是介导EMT发生的重要因子,SNAIL通过沉默E-Cadherin进而直接或间接促进EMT的发生。赖氨酰氧化酶样蛋白-2(Lysyl oxidase–like2 protein,LOXL2)是EMT的关键调控因子。有关研究发现LOXL2参与了SNAIL的蛋白质翻译后修饰,并且这种修饰可能依赖于K98和K137位点,而SUMO是最近发现的调控数百种核蛋白。LOXL2调控Snail的过程和机制还不清楚,基于上述研究和我们前期实验结果,我们提出以下科学假设:在胆管癌细胞中,LOXL2可能通过介导苏素化正性调控SNAIL蛋白的表达,并且这种调控可能与SANIL的K98及K137位点有关。目的:在胆管癌细胞株RBE和QBC939中,研究LOXL2调控SNAIL的过程及机制,有望为预防和治疗胆管癌提供新的靶点,也为其他肿瘤的治疗提供新思路。方法:为了研究LOXL2调控SNAIL的过程及机制,我们在胆管癌细胞株RBE和QBC939中瞬时转染EX-LOXL2、EX-LOXL2-EX-SENP、EX-LOXL2-Si-SUMO、EX-LOXL2-MU等质粒,然后通过免疫荧光和蛋白免疫印迹实验验证LOXL2对SNAIL的调控作用,通过免疫荧光、蛋白免疫印迹和免疫共沉淀实验检测LOXL2、SNAIL和SUMO的结合情况,再通过蛋白免疫印迹实验检验LOXL2调控SNAIL的位点。结果:⑴在胆管癌细胞RBE和QBC939中,瞬时转染EX-LOXL2质粒,SNAIL蛋白的表达水平增高,(蛋白质免疫共沉淀发现:转染EX-LOXL2,SNAIL与SUMO结合)EX-LOXL2可能介导了SNAIL与SUMO结合。⑵在胆管癌细胞RBE和QBC939中,双瞬时转染EX-LOXL2和EX-SENP质粒,SNAIL表达水平下降。双瞬时转染EX-LOXL2和Si-SUMO质粒,SNAIL的表达水平同时下降。⑶在胆管癌细胞RBE中,双瞬时转染EX-LOXL2和K98/K137位点双突变质粒,SNAIL的表达水平下降。结论:在胆管癌细胞RBE和QBC939中,LOXL2通过介导苏素化正性调控SNAIL,并且此过程与SNAIL的K98和K137位点有关。实验结果为胆管癌的预防与治疗提供了新的靶点及理论基础。