目的:11 α-O-2 methybutyryl-12 β-O-tigloyl-tenacigenin B(MT2)是从传统中药通光散的总苷元部位分离的C21甾体酯类化合物,所在课题组研究发现了通光散总苷元在体内外对抗肿瘤药物紫杉醇的增敏作用,继而发现分离纯化得到的单体化合物MT2对P-gp和代谢酶CYP3A4、CYP2C8、CYP2B6和CYP2C19活性的抑制作用,以及该化合物在体外增敏紫杉醇对HeLa、HCT-15、CNF和HepG2等肿瘤细胞的的细胞毒活性。但该化合物在体内是否具有增强化疗药物如紫杉醇的抗肿瘤活性?此外,该化合物给药后的药动学行为及其对紫杉醇的药代动力学有什么影响均不清楚。为此,本学位论文研究了 MT2在体内对紫杉醇的抑瘤作用和药动学行为的影响,以及MT2本身的药代动力学行为特征,为MT2开发为肿瘤化疗增效剂候选新药提供药效学和药代动力学实验依据。方法:一、MT2对紫杉醇的抑瘤作用的影响于雌性BALB/c裸鼠皮下注射Hela细胞建立荷瘤裸鼠模型,分别腹腔注射给予空白溶剂、紫杉醇、MT2、或紫杉醇联合MT2,每个给药组6只小鼠。隔日给药,连续5次,给药结束后停药观察6天,分别记录各给药组裸鼠的体重和肿瘤体积变化,实验结束后剥取各组裸鼠的肿瘤,拍照和称重,分析体重变化和各组裸鼠的质量数据,评估MT2对紫杉醇抗肿瘤活性的影响。二、MT2对紫杉醇在大鼠体内药动学的影响实验建立紫杉醇在大鼠血浆中的UPLC-MS/MS定量分析方法,分别测定大鼠经腹腔注射紫杉醇、腹腔注射高剂量MT2联用紫杉醇和腹腔注射低剂量MT2联用紫杉醇后三组大鼠各时间点的紫杉醇血药浓度,以非房室模型计算出三组大鼠紫杉醇的药代动力学参数,绘制药时-曲线,分析比较各组药代动力学参数差异,考察MT2对紫杉醇药代动力学的影响。三、MT2的血浆药代动力学实验建立MT2在大鼠血浆中的UPLC-MS/MS定量分析方法,分别测定大鼠经口服MT2高、低两个剂量组和经静脉注射高、中、低三个剂量组后MT2在五组大鼠各时间点的血药浓度,以非房室模型计算出各组大鼠MT2的药代动力学参数,绘制药时-曲线,计算出大鼠口服MT2的生物利用度,分析各剂量组的药代动力学行为。四、MT2血浆蛋白结合率实验建立MT2在磷酸盐缓冲液中的UPLC-MS/MS定量分析方法,采用平衡透析法考察MT2在高、中、低三个浓度下的大鼠血浆蛋白结合率。五、MT2在大鼠体内排泄实验建立MT2在大鼠胆汁、尿液和粪便三种基质中的UPLC-MS/MS定量分析方法,测定和计算在大鼠体内静脉注射MT2在各时间段三种排泄样品中的含量,对比MT2在三种排泄途径下的排泄速率、累计排泄量和总结该化合物在大鼠体内的排泄规律。六、MT2在大鼠组织、脏器的分布实验建立MT2在大鼠肝脏匀浆液中的UPLC-MS/MS定量分析方法,测定和计算在大鼠体内静脉注射MT2在不同时间点12种大鼠组织中的含量,考察MT2在各组织脏器的分布情况。七、MT2在大鼠肝微粒体中的代谢产物鉴定应用高分辨率质谱及代谢软件,对MT2在大鼠肝微粒体孵育体系中的代谢产物进行鉴定。结果:一、MT2能显著增强紫杉醇的体内抗肿瘤作用单用紫杉醇(8 mg/kg)能一定程度地抑制HeLa肿瘤的生长(抑制率18%),但和空白组相比差异不具有统计学意义(P>0.05);单用MT2(30 mg/kg)不影响肿瘤生长(抑制率-7%);紫杉醇与MT2联用能显著抑制肿瘤生长(抑制率96%,P=0.006<0.01,vs空白组),其中3只裸鼠体内肿瘤消失。实验中,未出现小鼠死亡或体重显著下降。二、MT2在大鼠体内对紫杉醇药代动力学的影响建立了紫杉醇在大鼠血浆中的UPLC-MS/MS定量分析方法,该法灵敏度高、专属性和重现性好,符合生物样品定量分析方法的要求。紫杉醇联用高剂量MT2(40 mg/kg)与单用紫杉醇组相比,除半衰期(t1/2,P=0.695>0.05)和达峰时间(tmax,P=0.448>0.05)的变化无统计学意义外,其他参数均有差异:紫杉醇的最高血药浓度(Cmax)和药时曲线下面积(AUC0-t)分别提高了 8倍(1729.05±602.20 vs195.56± 111.88,调整后P=0.002<0.01)和 5 倍(5671.385±2504.88 vs1060.17±567.78,调整后P=0.002<0.01),差异具有高度统计学意义;表观分布容积(Vz/F,调整后P=0.003<0.01)和消除率(Clz/F,调整后P=0.002<0.01)的差异具有高度统计学意义。紫杉醇联用低剂量MT2组与紫杉醇组相比,各参数的均值均有变化,但差异无统计学意义(均为调整后P>0.05);紫杉醇联用高剂量MT2组与紫杉醇联用低剂量MT2组的药代动力学参数相比(均为调整后P>0.05),差异无统计学意义,推断可能是紫杉醇联用低剂量MT2组(20 mg/kg)大鼠体内个体差异较大,参数离散程度高所致。结果表明,MT2高剂量组与紫杉醇联合用药时,不改变紫杉醇的t1/2和tmax,但可以影响紫杉醇Cmax、AUC、Vz/F和Clz/F等药代动力学参数。三、MT2在大鼠体内的药代动力学实验结果首次建立了 MT2在大鼠血浆中的UPLC-MS/MS定量分析方法。结果显示:静脉注射低、中、高三个剂量组的t1/2分别为2.64±0.39、2.53±0.30和3.68±1.11 h;MRT0-t 分别为 1.41±0.14、1.15±0.11 和 1.55±0.14 h,Clz/F 分别为 3.59±0.26、3.71±0.38和1.69±0.16 L/h/kg。三个剂量组Vz/F分别为13.67±2.16、13.56±2.30和9.03±3.08 L/kg,表明MT2除在血液中存在,还广泛分布在大鼠的组织器官中。灌胃给药5 min的血浆样品可检测出MT2,口服低剂量(40 mg/kg)和高剂量(100 mg/kg)的生物利用度(F,%)分别为1.09%和1.66%,t1/2分别为11.01±7.03和14.14±5.87 h,MRT0-t 分别为 8.84±1.62 h 和 12.29±1.89 h,表明该化合物口服吸收快、生物利用度低、首过效应明显,在体内滞留时间较长。两个剂量组在药时曲线吸收相段均出现波动,出现双峰或多峰现象,而在消除相阶段及静脉注射组均无此现象,表明MT2在大鼠体内不存在肝肠循环现象。四、MT2的大鼠血浆蛋白结合率首次建立了 MT2在磷酸盐缓冲液中的UPLC-MS/MS方法,因更换检测仪器,因此对MT2在血浆中含量测定方法进行了部分验证。采用平衡透析法测定MT2在大鼠血浆中的蛋白结合率结果:在200-10000 ng/mL浓度范围内,低(200 ng/mL)、中(2000 ng/mL)和高(10000 ng/mL)浓度的MT2与大鼠的血浆蛋白结合率分别为93.84%、94.35%和94.96%,表明MT2的大鼠血浆蛋白结合率高且无浓度依赖性。五、MT2在大鼠体内排泄情况分别建立了 MT2在大鼠胆汁、尿液和粪便三种排泄物中的UPLC-MS/MS定量分析方法,测定了大鼠经尾静脉注射20 mg/kg MT2后,该化合物在三种排泄样品不同时间段的浓度和计算含量。结果显示,MT2经胆汁24 h的累计排泄量占给药量的0.0193%,经尿液48 h的累计排泄量占给药量的0.0030%,经粪便48 h的累计排泄量占给药量的0.0693%,三种排泄途径累计排泄量为0.0916%,表明MT2在大鼠体内以原型药物排泄量极低,推测该化合物在大鼠体内主要是以生物转化代谢的方式消除。六、MT2在大鼠脏器中的分布情况建立了 MT2在大鼠肝脏中的UPLC-MS/MS定量分析方法,测定了大鼠经尾静脉注射20 mg/kg MT2后,在15 min、1 h和4 h三个时间点大鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑、胰腺、脂肪、肌肉、睾丸、子宫和卵巢12个组织的浓度和含量。结果显示,MT2在雌性大鼠的组织的浓度除15 min时的心、脑、脂肪、肌肉、胰腺和1 h时的脂肪中浓度与雄性大鼠的组织浓度相近,其余浓度均明显高于雄性大鼠,尤其是在1 h和4 h时的雌雄同组织浓度相差3倍以上,表明MT2在大鼠组织中的代谢和消除存在性别差异。MT2在雄性大鼠组织中的含量除脂肪外,其余组织浓度均迅速减低,4 h后浓度降低两个数量级,而脂肪在4 h的浓度与1 h相比,不降反升至7245.67 ng/g,表明MT2仅在雄性大鼠脂肪中有原型药物蓄积。在4 h时雌性大鼠的各组织浓度均高于2000 ng/g,尤其是在卵巢、肝、脂肪和胰腺浓度均高于10000 ng/g,表明MT2在雌性大鼠组织中存在原型药物蓄积,且在卵巢、肝、胰腺含量高,对此三种组织具有靶向性。七、MT2在大鼠肝微粒体的代谢研究建立UPLC-Q-TOF-MS/MS定性分析方法,对大鼠肝微粒体孵育样品MT2的代谢产物进行鉴定,检测及鉴定出MT2原药和五个Ⅰ相代谢产物,M1和M2为同分异构体,鉴定为三氧化产物(Tri-Oxidation),M3鉴定为去甲基二氧化产物(Demethylation and Di-Oxidation),M4鉴定为去甲基单氧化产物(Demethylation and Oxidation),M5鉴定为双氧化产物(Di-Oxidation),表明在大鼠肝微粒体中MT2的代谢方式为氧化反应。结论:一、本研究首次证明了中药通光散中的C2,甾体酯类单体化合物MT2在荷Hela细胞移植瘤裸鼠体内可显著增强紫杉醇的抗肿瘤活性。MT2高剂量组(40 mg/kg)与紫杉醇联合用药时,在不改变紫杉醇在大鼠体内的吸收速度和半衰期的情况下,可明显提高紫杉醇在大鼠体内的达峰浓度和药时曲线面积,降低表观分布容积和消除率,即两药联用时MT2对紫杉醇的药代动力学行为具有影响。二、首次对MT2在大鼠体内开展了药代动力学研究,建立了MT2在大鼠血浆、磷酸盐缓冲液、胆汁、尿液、粪便和肝脏等基质中灵敏、可靠的UPLC-MS/MS定量定性分析方法,分别对MT2在大鼠的血浆药代动力学、血浆蛋白结合率、排泄情况、组织分布和肝微粒体代谢进行了系统地研究,阐明了 MT2在大鼠体内的吸收、分布、代谢和排泄(ADME)特征和过程,发现MT2为高血浆蛋白结合率化合物,在大鼠体内口服吸收快,生物利用度低;经静脉注射后广泛分布于大鼠各组织脏器中,在大鼠脏器中代谢和消除存在性别差异,在雄鼠中除脂肪外,MT2在其他组织中无蓄积性,但在雌性大鼠组织中存在原型药物蓄积,并对卵巢、肝、胰腺三种组织具有靶向性;在体内消除方式以生物转化和代谢为主,极少量以原型排泄出体外;该化合物在大鼠肝微粒体中的代谢途径为氧化反应。