目的：(1)研究兔角膜基质细胞在体外培养的生物学特性,为组织工程角膜基质层的构建奠定基础。(2)观察兔角膜基质细胞在体外构建的胶原蛋白凝胶表面的生长状态,探讨以胶原凝胶制备组织工程角膜基质层的可行性。(3)检测转谷氨酰胺酶交联胶原凝胶对三维培养的角膜基质细胞的影响,探讨高机械性能组织工程角膜基质层新途径。方法：(1)分别采用消化-植块法、Ⅱ型胶原酶消化法获取原代兔角膜基质细胞,观察细胞贴壁情况,待细胞融合时进行消化传代,每天观察传代细胞的形态和生长情况。(2)在凝胶化的胶原面滴加密度为5×104个／ml的第3代细胞悬液,细胞和凝胶温箱内孵育1h,使细胞粘附在凝胶表面,随后加入适量的DMEM继续培养,隔日换液,每天观察细胞在胶原面的生长情况。(3)以密度为5×104个／ml将第3代细胞悬液与胶原凝胶在冰块上混匀,以加转谷氨酰胺酶(3.5U／mg)交联为实验组与不加酶交联为对照组。每天倒置显微镜下观察细胞生长情况。分别在培养后的1、2、3、5d行Alamar-Blue试剂法检测细胞增殖；第7、14、21、28d免疫荧光染色凝胶内细胞波形蛋白；第14、21d检测透光度；第28d酶消化法检测胶原凝胶抗消化能力。结果：(1)消化-植块法培养兔角膜基质细胞,4-5d后开始有细胞从粘附紧密的植块边缘长出,培养2w-3w左右,细胞基本达到融合形成活性好的单层。单纯胶原酶消化法接种兔角膜基质细胞,4h后开始贴壁,培养5-6d细胞达到融合形成活性好的单层。二种方法得到的细胞在经多次传代后原有的形态和增殖功能,未见明显改变。(2)胶原凝胶表面接种的基质细胞3h后即附着其表面生长,24h后即与凝胶紧密粘附,培养4-5d可见细胞间相互连接明显,伪足伸入凝胶内部,后期胶原凝胶出现明显降解和收缩。(3)实验组细胞在胶原凝胶内附着和伸展优于对照组,细胞在凝胶内呈树枝状生长。两组细胞均随培养时间延长明显增殖(P=0.000)。共聚焦显微镜下观察两组细胞胞浆波形蛋白均表达阳性,实验组较对照组细胞伪足丰富。实验组透光度稍差于对照组,但其稳定性优于对照组。交联后的胶原凝胶抵抗胶原酶消化的能力显著增强。结论：(1)本研究探讨了兔角膜基质细胞在体外培养的生物学特性,提供了方便高效的培养方法,并对比了不同的细胞培养方法、分离方法的特点。(2)体外构建的胶原蛋白凝胶与角膜基质细胞有良好的生物相容性,为进一步组织工程的构建打下了良好的基础。(3)酶交联的胶原凝胶对角膜基质细胞无毒性作用,细胞生长良好,更接近于生理状态。重构的三维基质层结构更加稳定,有利于组织工程角膜基质层的构建。