斑节对虾属于甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、游泳亚目(Natantia)、对虾科(penaeidae)、对虾属(penaeus),是对虾属中较大一种,具有很高的经济和营养价值[1]。但是,在斑节对虾养殖过程中,亲虾繁育技术一直是一个非常重要的限制因素[2,3]。随着分子生物学技术的发展,人们越来越关注甲壳类动物尤其是对虾中细胞周期蛋白基因的功能,对细胞周期蛋白的分子调控机制已有所研究。细胞周期蛋白是参与细胞周期调控的重要因子,细胞周期中,细胞周期蛋白家族的变化决定着细胞周期中的一系列过程[4],如DNA复制、染色体加倍、时相转换、细胞周期的起始与结束等等。有研究报道,在斑节对虾性腺发育的相关功能基因中,细胞周期素对其正常的生长、繁殖、发育和遗传具有决定性作用[5]。因此,在对斑节对虾亲虾繁育的探寻和研究中[6,7],与斑节对虾卵巢发育相关的细胞周期蛋白家族基因成为研究热点。在本研究中,从分子水平和蛋白水平层面,我们对斑节对虾的细胞周期蛋白Y(Pm-cyclin Y)基因进行了研究,探索Pm-cyclin Y与斑节对虾卵巢发育的相关性,以期为斑节对虾卵巢发育的分子调控机理充实理论依据。另外,在本实验室对斑节对虾细胞周期蛋白E(Pm-cyclin E)已有研究的基础上,我们对Pm-cyclin E做了进一步探索,以期为Pm-cyclin E的蛋白相互作用研究奠定基础。本实验首先通过对斑节对虾进行高通量测序,建立EST文库,筛选出与斑节对虾卵巢发育相关的细胞周期蛋白Y的EST序列。其次,在基因水平上:设计引物,利用SMART-RACE技术克隆出全长基因的c DNA序列并进行生物信息学分析;设计特异性引物,利用基因组步移技术得到目的基因的基因组全序列,找到启动子,并对其结果进行生物信息学分析;利用相对实时荧光定量PCR技术对目的基因在斑节对虾卵巢、肝胰腺、眼柄等10个组织中的分布及卵巢不同发育时期的表达情况进行研究,用统计学方法分析实验结果,从而在m RNA水平探索目的基因与斑节对虾卵巢发育的关系。然后,在蛋白水平上,构建Pm-cyclin Y与载体p ET21a的重组质粒,在经优化后的原核表达条件下,诱导表达获得重组蛋白;用镍柱亲和层析方法纯化蛋白,检测达到规定浓度后送公司做抗体;得到的斑节对虾目的基因多克隆抗体用于斑节对虾卵巢发育各期的免疫印迹和免疫组化实验,从而达到在蛋白水平探索目的基因与斑节对虾卵巢发育的关系。除此之外,对于Pm-cyclin E,结合已有研究报道和本实验室已有研究基础,我们对其补充了在斑节对虾卵巢发育各期的m RNA水平验证,并且在蛋白水平做了原核表达和免疫组织化学实验,并利用pull-down技术对Pm-cyclin E在蛋白相互作用方面做了初步探索。结果概述如下:1)Pm-cyclin Y基因c DNA全长1576bp,其中包含108 bp的5‘非编码区(UTR)和439bp的3‘非编码区(UTR)以及1029bp的开放阅读框(ORF),可编码342个氨基酸。生物信息学分析显示,其编码的氨基酸序列有一个保守的周期蛋白框(cyclin box)同源结构域(172-257aa),预测的分子量约为38.7k D,理论等电点6.64。Pm-cyclin Y与蚤状溞(Daphnia pulex)的细胞周期蛋白Y具有高度同源性(相似性为67%)。Blastx分析显示,Pm-cyclin Y预测的氨基酸序列和其他已知周期蛋白Y具有非常高的同源性;Signal P 3.0程序分析显示,Pm-cyclin Y不包含信号肽序列;Net NGlyc1.0 Server程序分析显示,Pm-cyclin Y不存在糖基化位点(N-Glycosylation);Net Phos2.0预测结果显示:Pm-cyclin Y共含有24个潜在的磷酸化位点,包括17个Ser位点,2个Thr位点和5个Tyr位点。PHYRE2软件预测Pm-cyclin Y编码蛋白的二级结构显示:Pm-cyclin Y编码的蛋白包括13个α螺旋,螺旋占总结构的54%;1个β折叠片,占总结构的1%;无规则卷曲结构占47%。Clustalx1.83软件和Bio Edit软件对Pm-cyclin Y进行多序列比对结果显示,Pm-cyclin Y与大黄蜂、红火蚁和蚤状溞高度相似,相似性分别为72%、71%和67%。MAGA6.0软件构建系统进化树结果显示,斑节对虾的Pm-cyclin Y编码蛋白和大黄蜂、红火蚁、蚤状溞以及果蝇聚为一支,与哺乳类、鱼类、爬行类等代表物种的cyclin Y编码蛋白聚类。2)实时定量PCR显示Pm-cyclin Y的m RNA在卵巢的表达量显著高于其他组织(P<0.05);并且在卵巢5个不同发育期都有表达,在III期卵巢中的表达量最高。3)根据已知EST序列,设计Pm-cyclin Y原核表达引物,成功从斑节对虾的卵巢c DNA中克隆出周期蛋白Y的开放阅读框(ORF),并与p ET-21a载体连接,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导成功表达后获得重组蛋白并成功纯化获得比较纯的融合蛋白,BCA试剂盒检测蛋白浓度达标后,将该重组蛋白为抗原送公司设计抗体(命名为R-CYCY)。4)取斑节对虾卵巢发育各期的组织,制备石蜡切片。并以R-CYCY为抗体进行免疫组化实验,结果显示I期(卵原细胞期)和II期(核染色质期)的卵黄发生前期卵母细胞的细胞质中有信号,III期(周边核仁期)和IV期(卵黄囊期)的初级卵母细胞的胞质中有较强信号,胞核中也有微弱信号,V期(成熟期)的信号主要集中在卵母细胞的细胞质,在皮质棒和细胞核中没检测到信号。5)对Pm-cyclin E在斑节对虾卵巢发育各期成功进行了m RNA水平和蛋白水平的研究,结果显示,在m RNA水平,Pm-cyclin E在卵巢发育III期表达量最高,且明显高于其他各期;在蛋白水平,成功获得Pm-cyclin E与p RSET的重组质粒,并经诱导表达、蛋白纯化和抗体制备等实验,获得Pm-cyclin E的多克隆抗体,免疫组化结果显示:I期和II期的卵黄发生前期卵母细胞的细胞质中有信号,III期和IV期的初级卵母细胞的细胞核中有较强信号,细胞质中没有信号,V期的信号在卵母细胞的胞质和胞核中都存在,但在皮质棒中没有信号。本研究主要在分子水平与蛋白水平上对斑节对虾细胞周期蛋白的家族成员Y和E做了初步探索,在笔者实验室已有研究成果的基础上得出了进一步的结论,不但证明了细胞周期蛋白家族成员与斑节对虾卵巢发育相关,还得出了其主要调控的斑节对虾卵巢发育的某一特定发育期,为细胞周期蛋白参与斑节对虾卵巢发育的分子调控机制提供理论基础。