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目的鉴定和分离以CD105+为标志的人肾癌干细胞,并通过比较CD105-shRNA和不同microRNA在肾癌干细胞和普通肾癌细胞中的功能,探讨CD105和干细胞相关microRNA通过杀灭肾癌干细胞来治疗肾癌的可行性和有效性。方法采取ACHN肾癌细胞系在免疫缺陷小鼠BALB/c-nu皮下成瘤的方式获得肾癌组织细胞,并通过外源性anti-hCD105-PE抗体标记和流式细胞术分离CD105阳性的人肾癌干细胞。分别采用成球实验、成上皮诱导分化实验鉴定CD105(+)细胞的肿瘤干细胞特性,并通过MTS和EdU细胞增殖实验、周期测定、集落形成和细胞衰老程度测定等手段鉴定以CD105(+)为标志的肾癌干细胞的增殖特性和细胞衰老程度。在此基础上,采用microRNA数据库检索、文献检索和qRT-PCR验证的方式筛选在干细胞和非干细胞中差异性表达的microRNA,并采用双荧光素酶的方式确定microRNA和其靶蛋白mRNA3’端非编码区之间的结合程度,最终将筛选得到的microRNA采用mimics或者慢病毒转染的方式探讨其在肾癌干细胞的体外成球能力、顺铂耐药能力、迁移能力中的作用。结果CD105(+)肾癌细胞的成球能力明显强于CD105(-)细胞系ACHN,且在RPMI-1640培养基中培养两周后,干细胞标志CXCR4、OCT-4、NANOG、HIF1A、DLK-1和EZH2逐渐降低；在DMEM-HG+10%FBS培养基中培养两周后,其干细胞标志CXCRH-4、NANOG、 DLK-1、OCT-4和KLF4表达明显下降。在其他鉴定实验中,虽然ACHN-CD105(+)细胞的增殖速度下降且存在G0期阻滞,但其形成集落和成球能力均强于ACHN-CD105(-)细胞,衰老程度也显著低于ACHN-CD105(-)细胞。在此基础上,我们鉴定出27个在CD105(+)肾癌干细胞中差异性表达的microRNA,并证实miR-34a、miR-155、miR-200a可不同程度结合CD105的mRNA从而下调其表达,使CD105(+)肾癌干细胞对顺铂耐药性下降,而采用shRNA敲降CD105的方式,我们也发现CD105具有维持ACHN-CD105(+)细胞耐药性并防止其衰老的作用；同时我们也证明miR-335可结合OCT-4蛋白的mRNA从而降低其表达,并产生抗迁移、降低成球率和抑制SOX-2、OCT-4、NANOG、KLF-4等干细胞因子表达的效应。结论经ACHN细胞系于BALB/c-nu裸鼠皮下移植瘤细胞分选获得的CD105(+)细胞具有肿瘤干细胞特性,可初步认定为肾癌干细胞；miR-34a、miR-155、miR-200a可通过下调CD105降低CD105(+)肾癌干细胞对顺铂的耐药性；miR-335可通过下调OCT-4抑制CD105(+)肾癌干细胞的迁移能力、成球能力。第一部分人肾癌干细胞的分离、培养和鉴定目的分离和鉴定以CD105(+)为标志的人肾癌干细胞方法将肾癌细胞系ACHN接种于BALB/c-nu裸鼠的腋窝皮肤下,一月后将形成的肿瘤消化成单细胞悬液并采用anti-hCD105-PE流式抗体4-C孵育半小时,于流式分选仪上分离得到ACHN-CD105(+)细胞并采用肾癌干细胞培养基扩增和冻存细胞。采用体外成球实验、RPMI-1640+10%FBS和DMEM-HG+10%FBS培养基诱导分化实验、顺铂耐药性实验、MTS和EdU细胞增殖实验、周期测定、集落形成实验和细胞衰老程度测定的方式鉴定ACHN-CD105(+)细胞的增殖、分化和成瘤特性。结果CD105(+)细胞仅占ACHN细胞系皮下移植瘤细胞的3.05%,符合肿瘤干细胞理论中“极低比例的细胞驱动肿瘤生长”的观点。ACHN-CDl05(+)可在肾癌干细胞培养基中持续扩增并维持CD105和干细胞相关因子的表达水平。在后续功能鉴定中,ACHN-CD105(+)细胞的成球率明显高于ACHN-CD105(-)细胞,且在RPMI-1640+10%FBS和DMEM-HG+10%FBS培养基中培养两周后干细胞相关因子CXCR-4、OCT-4、NANOG表达下降,顺铂耐药实验显示ACHN-CD105(+)细胞的耐药性明显强于ACHN-CD105(-)细胞,细胞增殖实验和集落形成实验显示ACHN-CD105(+)细胞增殖速度低于ACHN-CD105(-)细胞且有GO期阻滞现象,但其集落形成能力显著优于后者。细胞衰老程度测定显示,ACHN-CD105(+)细胞衰老程度低于ACHN-CD105(-)细胞。结论经ACHN细胞系于BALB/c-nu裸鼠皮下移植瘤细胞分选获得的CD105(+)细胞具有肿瘤干细胞特性,可初步认定为肾癌干细胞。第二部分miRNA在人肾癌干细胞中的功能和机制研究目的筛选可抑制ACHN-CD105(+)干细胞特性的miRNA并探讨其作用机制方法采用miRNA数据库筛选、文献检索和qRT-PCR验证的方式筛选具有抑制ACHN-CD105(+)干细胞特性的miRNA,以双荧光素酶实验确定miRNA和其靶蛋白mRNA之间的结合程度并采取顺铂耐药性实验、细胞衰老程度测定、细胞迁移实验和成球实验检测经过筛选获得的miRNA的有效性和用于在体实验的可行性。结果我们筛选得到27个在ACHN-CD105(+)和ACHN-CD105(-)细胞间差异性表达的miRNA,后期又确定了miR-34a、miR-155、miR-200a的靶标为CD105, miR-335的靶标为OCT-4。在转染了miR-34a、miR-155、miR-200a的化学合成mimics之后,ACHN-CD105(+)细胞对顺铂的耐药性显著下降；在转染miR-335的过表达慢病毒后,ACHN-CD105(+)细胞的迁移迁移能力和成球能力下降,包括OCT-4、NANOG、SOX-2、KLF-4在内的多种干细胞相关因子表达降低。结论miR-34a、miR-155、miR-200a可通过下调CD105降低CD105(+)肾癌干细胞对顺铂的耐药性;miR-335可通过下调OCT-4抑制CD105(+)肾癌干细胞的迁移能力、成球能力。