论文部分内容阅读
第一部分原代海马神经元的培养、形态学观察以及纯度鉴定目的:通过对新生24h内SD大鼠海马神经元培养,掌握大鼠海马神经元体外培养的方法,利用免疫荧光细胞化学鉴定神经元纯度。方法:取新生24 h内的SD乳鼠,用75%乙醇消毒,剪断头,分层剪开皮肤和颅骨,用弯镊取出大脑,置于预冷的DMEM液中,快速剥离出两侧海马组织,在解剖显微镜下去除海马的血管和被膜,用显微剪把组织剪碎,再移入木瓜蛋白酶和DNA酶Ⅰ的混合消化液中,置于37℃,5%CO2培养箱中消化30 min。用吸管将组织块移入含有10%胎牛血清的DMEM液中终止消化5min,再把组织块移入接种培养基中,用1ml长枪头匀速、轻柔地反复吹打,直至液体变浑浊,没有块状物质,之后过200目的细胞筛。在显微镜下进行活细胞计数,制成1x106/ml密度的细胞悬液,种植于多聚赖氨酸处理过的6孔培养板中,每孔加2.5ml,置于37℃,5%CO2的培养箱内培养。6h后全量更换无血清的维持培养基。以后,每隔一天半量换液一次。在第四天的时候,加入终浓度10m M的5fu和尿嘧啶,来抑制胶质细胞的生长。在显微镜下观察神经元的生长情况。海马神经元培养7d后,应用免疫荧光化学技术,用荧光标记的MAP-2标记神经元,DAPI标记所有细胞的细胞核。在荧光显微镜下,随机选取5个孔,分为5组,分别在低倍视野(4×10)和高倍视野(10×20倍)下观察,拍照。计数神经元和所有细胞核的数目,并计算神经元所占的百分比,取均值作为每孔神经元纯度。结果:原代培养海马神经元,神经元标志物单克隆神经元微管相关蛋白-2(MAP-2)抗体和核抗体DAPI荧光染色后,在荧光倒置显微镜下鉴定,计算海马神经元纯度约为(91.52±1.70)%。小结:体外培养的原代SD新生乳鼠海马神经元形态典型,且海马神经元纯度在90%以上,能够满足进一步的实验要求。第二部分不同浓度的氯胺酮对海马神经元树突棘的影响目的:观察不同浓度氯胺酮对发育期海马神经元树突棘的影响。方法:取原代培养至第5 d的海马神经元,随机分为4组:(1)C组(空白对照组):加入等体积的维持培养基(2)K1组:加入氯胺酮,终浓度为100μM(3)K2组:加入氯胺酮,终浓度为300μM(4)K3组:加入氯胺酮,终浓度为500μM。各组继续培养6小时后,固定,用荧光染料V22888染色。之后,在共聚焦显微镜下观察,随机摄取荧光图片,并计算各组神经元树突棘的密度以及平均长度。结果:1树突棘的密度(F=13.298,P=0.002):K2组及K3组与C组比较,数值有所降低,差异有统计学意义(P<0.05);K1组与C组比较,差异无统计学意义。K3组与K2组比较,数值有所降低,差异有统计学意义(P<0.05);2树突棘的平均长度(F=30.440,P=0.000):K2组及K3组与C组比较,数值有所降低,差异有统计学意义(P<0.05);K1组与C组比较,差异无统计学意义。K3组与K2组比较,差异无统计学意义。小结:氯胺酮对海马神经元树突棘的影响具有剂量依赖性。随着氯胺酮浓度的升高,其对树突棘的损伤也越明显,其神经毒性作用就越强。第三部分氯胺酮对原代培养海马神经元的神经毒性的作用机制目的:1应用Westem blot技术检测使用氯胺酮后RhoA及其下游分子ROCK的表达量的变化,以及使用Y-27632后RhoA和ROCK蛋白表达的变化。2应用免疫荧光细胞化学技术标记神经元树突棘,阐明RhoA-ROCK信号通路在氯胺酮对原代培养的海马神经元毒性中的作用。方法:取原代培养至第5 d的海马神经元,随机分为4组:(1)C组(空白对照组):加入等体积的维持培养基(2)Y组:加入Y-27632,终浓度为10μM(3)K组:加入氯胺酮,终浓度为300μM(4)K+Y组:加入氯胺酮和Y-27632,终浓度分别为300μM和10μM。1将各组再培养6小时后,提取蛋白,应用Western blot技术检测各组RhoA和ROCK蛋白表达的变化。2将各组再培养6小时后,用V22888染色,在共聚焦显微镜下观察各组神经元树突棘的变化。结果:1 RhoA(F=404.774,P=0.000):Y组与C组比较,RhoA蛋白表达量差异无统计学意义;K组与C组比较,RhoA蛋白表达表达显著增高,且有统计学意义(P<0.05)。K+Y组与K组比较,RhoA蛋白表达量差异无统计学意义;2 ROCK(F=721.413,P=0.000):Y组与C组比较,ROCK蛋白表达量差异无统计学意义;K组与C组比较,ROCK蛋白表达表达显著增高,且有统计学意义(P<0.05)。K+Y组与K组比较,ROCK蛋白表达量显著降低,且差异有统计学意义(P<0.05);3树突棘的密度(F=11.383,P=0.003):Y组与C组比较,差异无统计学意义;K组与C组比较,数值有所降低,差异有统计学意义(P<0.05)。K+Y组与K组比较,数值有所升高,差异有统计学意义(P<0.05);4树突棘的平均长度(F=26.152,P=0.000):Y组与C组比较,差异无统计学意义;K组与C组比较,数值有所降低,差异有统计学意义(P<0.05)。K+Y组与K组比较,数值有所升高,差异有统计学意义(P<0.05)。小结:1氯胺酮可通过激活RhoA-ROCK信号转导通路损伤神经元树突棘,并发挥其神经毒性作用。2 Y-27632可减轻氯胺酮对树突棘的损伤,减弱氯胺酮的神经毒性作用,从而起到神经保护作用。结论:氯胺酮可通过RhoA-ROCK信号转导通路发挥神经毒性作用。