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肺癌是我国发病率最高的恶性肿瘤,其病情进展迅速、年轻化趋势明显。据统计,2017年我国肺癌的年增长率为26.9%,预计到2025年肺癌相关的死亡将高达100万例[1],肺癌已成为危害国人健康的头号杀手。放射治疗是肺癌最主要的局部治疗手段,新近高剂量立体定向放射治疗的应用使肺癌的局部控制率较传统放疗明显提高,成为不能耐受手术早期非小细胞肺癌的根治性手段[2],但在高剂量立体定向放疗后仍会有10-25%的肺癌患者出现局部和区域的复发[3]。放疗抵抗成为制约肺癌治疗疗效提高的瓶颈。因此,深入研究肺癌放射治疗抵抗的分子机制,寻找有效的增敏靶标仍是目前亟待解决的难题。研究证实,肿瘤抗性不仅与肿瘤细胞自身耐药性相关,肿瘤微环境(Tumor rmcroenvironment,TME)在肺癌的放疗抵抗中也发挥重要作用。肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)作为TME中一种数量最丰富的间质组分,是肿瘤细胞抗性维持的关键调节子,在肿瘤的复发和治疗抵抗中发挥重要作用[4]。为此,对CAFs相关分子事件的深入探索有望为抗肿瘤的临床治疗提供新的思路。外泌体(exosome,EXO),一种细胞分泌的直径约30-200nm的膜性囊泡,是细胞间“crosstalk”的重要介质。外泌体能稳定的存在于多种体液和细胞培养基中,其显著的生物优效性使外泌体迅速成为最具研究价值的新兴热点。外泌体通过对包装的信息物质进行靶向投递从而对受体细胞功能发挥调控作用。研究证实,X射线照射后CAFs释放外泌体增多[5],并在肿瘤细胞膜表面诱导CD29/CD81复合物形成,使其对外泌体的摄取明显增强[6]。对胰腺癌的研究也发现,抗肿瘤治疗后CAFs释放的外泌体中包含了更多的促抗性因子,能明显促进周围肿瘤细胞增殖和治疗抗性[7],但大分割放疗对CAFs外泌体的影响如何,目前尚不清楚。对外泌体内物质的研究发现,长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)能在外泌体中稳定传递而避免被RNA酶降解[8],其作为一类长度大于200bp的转录本,通过对基因转录和翻译水平的广泛调控,参与包括肿瘤发生、治疗抵抗的各种病理和生理过程[9]。上述研究结果促使我们思考,肺癌放疗后复发是否由X线照射的CAFs释放了差异lncRNA表达谱的外泌体介导呢?基于上述研究背景,我们拟开展如下的研究。[目 的]阐明肿瘤相关成纤维细胞外泌体水平传递lncRNA KCNQ1OT1介导肺癌细胞辐射抵抗作用和机制。[方法](一)对新鲜肺腺癌手术标本行原代分离、培养CAFs,利用流式细胞术和细胞免疫荧光检测CAFs相关标记物的表达进行鉴定;在此基础上建立CAFs与肺癌细胞株体外非接触共培养体系,通过CCK-8比色法、碘化丙啶(PI)染色法和Transwell技术分别检测细胞增殖、周期、迁移和侵袭,通过克隆形成实验观察0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy和8 Gy照射后细胞的存活能力,分析CAFs对共培养肺癌细胞生物学行为的影响。(二)采用超速离心法分离提取CAFs外泌体,并通过电镜和粒径分析对外泌体形态、平均粒径和粒径主峰进行鉴定;在肺癌细胞培养基中加入CAFs外泌体,通过PKH67染色法标记不同时相点肺癌细胞摄取外泌体的情况;进一步设立肺癌细胞对照组(A549/A549)、外泌体组(CAF-EXO/A549)、外泌体分泌抑制组(CAFs(GW4869)/A549)和 CAF 辐射后外泌体组(CAF-14Gy-EXO/A549),观察外泌体对肺癌细胞增殖、周期、侵袭、侵袭和放疗敏感性等细胞功能的变化;并通过第二代测序技术检测X射线照射后CAFs细胞外泌体中lncRNAs表达谱的变化,分析辐射处理后CAFs外泌体影响肺癌细胞放疗敏感性可能的分子机制;(三)通过siRNA技术干扰CAFs中lncRNA KCNQ1OT1的表达,设立对照组(CAFs-NC/A549),KCNQ1OT1 表达下调组(CAFs-KCNQ1 OT1-siRNA/A549),检测lncRNAKCNQ1OT1对共培养肺癌细胞生物学特性的影响。[结 果](一)利用肺癌组织原代分离培养法可以获取a-SMA(+)、Vimentin(+)、SDF-1(+)和CK-18(-)典型分子特征的CAFs,提示其可作为细胞模型进行后续实验研究;CCK8实验结果显示,CAFs共培养能显著增加A549细胞的增殖能力(P<0.05),且对14 Gy照射的A549细胞亦能发挥促增殖作用(P<0.05);克隆形成实验结果显示,CAFs共培养能明显提高A549细胞在2-8 Gy的克隆形成能力(P<0.05);周期结果显示,CAFs共培养显著促进A549细胞的G1/S转换,使其S期细胞比例明显增加(P<0.05),且对14Gy照射的A549细胞亦能发挥促G1/S转换作用(P<0.05);细胞迁移和侵袭结果显示,CAFs共培养能使A549细胞的体外迁移侵袭能力显著增强(P<0.05)。(二)利用超高速离心法分离提取CAFs培养基中的外泌体行电镜鉴定示:30-200nm杯状有包膜小体;粒径分析示:平均粒径直径为135.7nm,粒径主峰在141.8nm,20nm-200nm直径的粒径百分比为72.3%;采用流式细胞检测外泌体表面蛋白结果示:表面蛋白CD63阳性表达率为59.1%,CD81阳性表达率为51.7%;外泌体传递结果示:A549细胞能摄取PKH67标记的外泌体,摄入量呈明显时间依赖性,其中240 min的荧光强度最大,以上结果表明通过超高速离心法可以成功获取外泌体用于后续实验研究。进一步CCK-8实验、克隆形成实验和细胞周期分析结果显示:与CAFs-EXO/A549组相比,CAFs(GW4869)/A549组显著抑制了肺癌细胞A549增殖(P<0.05),明显降低其2-8Gy的克隆形成能力(P<0.05),G1细胞周期比例增高;而CAF-14Gy-EXO/A549组显著促进A549细胞增殖(P<0.05),明显增加2-8Gy的克隆形成能力(P<0.05),同时显著提高肺癌细胞A549的S期细胞比例(P<0.05)。第二代测序技术检测14Gy照射的CAFs-EXO中lncRNAs表达谱的结果发现,与CAFs-EXO相比,CAFs-14Gy-EXO组中lncRNA表达谱差异明显,上调分子9个,下调分子12个,其中lncRNA KCNQ1OT1的表达增高>3倍,qPCR结果亦证实CAFs-14Gy-EXO组中lncRNA KCNQ1OT1表达较对照组明显增高(P<0.05)。(三)KCNQ1OT1-siRNA通过脂质体方法转染CAFs后,qPCR检测结果显示,siRNA明显下调CAFs中KCNQ1OT1的表达。CCK-8实验、克隆形成实验和细胞周期分析结果显示:与CAFs-NC/A549组相比,CAFs-KCNQ1OT1-siRNA/A549能明显抑制共培养A549细胞增殖(P<0.05),显著降低其2-8Gy的克隆形成能力(P<0.05),同时A549的S期细胞下降,G1期细胞比例增加(P<0.05)。[结 论]1.肺癌组织原代分离培养可以获得具有典型分子特征的CAFs细胞;2.CAFs能明显促进共培养肺癌A549细胞增殖,增加共培养肺癌A549细胞放射治疗抵抗性,其放疗抵抗效应可能与A549的G1/S检查点失效、S期细胞增多相关;3.CAFs对共培养肺癌A549细胞的迁移侵袭具有促进作用:4.超高速离心法可以成功从CAFs培养基中分离得到具有典型结构特征的外泌体;5.肺癌A549细胞对CAFs外泌体的摄取呈明显的时间依赖性,随着时间延长摄取量增加:6.CAFs细胞外泌体促进肺癌A549细胞增殖、增加其放疗抵抗性的效应,可以被外泌体分泌阻断剂GW4869所拮抗,表明CAFs对共培养肺癌A549细胞生物学功能的影响是由CAFs分泌的外泌体所介导的;7.X线照射的CAFs能进一步活化A549细胞的增殖和放疗抗性,其可能与CAFs外泌体中差异表达的lncRNA相关,其中lncRNA KCNQ1OT1表达明显增高;8.下调CAFs中lncRNAKCNQ1OT1表达,能抑制共培养肺癌A549细胞增殖,增加其放疗敏感性及G1期细胞比例,表明外泌体中lncRNA KCNQ1OT1是介导肺癌A549细胞放疗抵抗的关键分子。本研究从肿瘤微环境角度探讨肺癌细胞放疗抵抗分子机制,上述研究结果揭示了 CAFs外泌体是促进肺癌放疗抵抗的重要介质,其可能是通过水平传递lncRNAKCNQ1OT1实现的,相关研究结果为以CAFs外泌体为切入点有效逆转肺癌细胞的放疗抵抗作用提供了部分新的的线索。