研究背景神经母细胞瘤是儿童期较为难治的恶性实体肿瘤之一,远期疗效较差。因此,开展儿童神经母细胞瘤的相关基础研究,具有重要意义。既往研究已充分显示,MYCN基因突变与神经母细胞瘤的发生、发展及不良预后密切相关。近年研究发现,DDX1(Dead box 1)基因在神经母细胞瘤中与MYCN基因共同扩增,提示DDX1基因表达在神经母细胞瘤发生与发展中可能具有重要意义。本研究通过验证DDX1基因在神经母细胞瘤高表达的基础上,探索和阐明了DDX1基因与神经母细胞瘤的肿瘤细胞生物学行为和化疗耐药等方面的相关性。为深入研究神经母细胞瘤发病机制和DDX1基因相关研究提供实验依据,以探索DDX1基因表达可能作为神经母细胞瘤临床诊治预后分析因素或治疗靶点的潜在价值。第一部分:DDX1在神经母细胞瘤中的表达目的:探讨神经母细胞瘤临床标本中瘤组织及瘤旁组织中DDX1(Dead box 1)基因的表达,验证DDX1基因在神经母细胞瘤中高表达,为本课题研究提供理论与实验依据。方法:1.神经母细胞瘤DDX1表达:取5例初诊儿童神经母细胞瘤的瘤组织及瘤旁组织(至少距离瘤组织2 cm以上的非瘤组织),固定于4%的甲醛溶液中。将以上样品石蜡包埋和切片后,采用DDX1抗体行免疫组化实验,观察瘤组织及瘤旁组织中DDX1的表达。2.免疫组化法半定量DDX1评分标准:A.染色程度评分:不着色(0分);浅着色(1分);着色明显(2分);深着色(3分)。B.阳性细胞比例:阳性细胞:<10%(0分);10%~30%(1分);31%~60%(2分);≥61%(3分)。3.最终评分计算:(1)评分计算公式:(A+B)/2。(2)半定量换算:评分0~1分计为“-”;1.1~2.0分计为“+”;2.1~3.0分计为“++”;3.1~5.0计为“+++”。结果:经免疫组化检测5例标本,每例的检测结果均显示,肿瘤组织的DDX1表达染色评分和阳性细胞百分率均明显高于瘤旁组织。瘤组织中DDX1表达最终评分均值为1.8分,均为阳性;而瘤旁组织DDX1表达评分均值为0.5分,定量换算均为“-”,提示神经母细胞瘤组织的DDX1表达明显高于瘤旁非肿瘤组织。结论:结果显示,神经母细胞瘤的肿瘤组织确实存在DDX1高表达,为本课题开展DDX1基因与神经母细胞瘤的相关性研究,提供充分的理论与实验依据。第二部分:靶向DDX1基因敲减稳转株的构建目的:建立DDX1基因敲减的SK-N-BE(2)细胞系,为后续开展DDX1基因表达与神经母细胞瘤生物学行为相关性研究,提供有效实验条件。方法:1.设计sh靶点,构建p Lenti6.3-EGFP-sh DDX1干扰慢病毒载体,并使用293T细胞包装慢病毒。2.将包装好的病毒感染SK-N-BE(2)细胞,感染成功的细胞会稳定表达GFP绿色荧光。3.使用q PCR及Western blot技术检测各个靶点的敲减效率,并选择效率最高的靶点进行后续实验。结果:经q PCR及Western blot实验均显示,2号靶点的敲减效率最高(>60%),成功建立DDX1敲减的SK-N-BE(2)细胞系。结论:使用慢病毒感染的方法,可以成功得到DDX1敲减的SK-N-BE(2)稳定细胞株。为本课题开展DDX1对神经母细胞瘤细胞的生物学行为影响相关研究,提供有效实验条件。第三部分:DDX1对SK-N-BE(2)细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响目的:观察SK-N-BE(2)/Blank、SK-N-BE(2)/sh V和SK-N-BE(2)/sh DDX1的细胞周期、增殖能力和细胞凋亡等方面的差异,揭示DDX1对神经母细胞瘤的细胞活力影响。方法:1.CCK-8法观察细胞增殖能力:将生长状态良好、处于对数生长期的SK-N-BE(2)/Blank、SK-N-BE(2)/sh V和SK-N-BE(2)/sh DDX1细胞接种于96孔板,每孔接种数目为2000个细胞,并设5个副孔。使用CCK-8试剂盒分别检测12 h、24 h、36 h、48 h 3组细胞的细胞数,并取平均值,以时间(h)为横坐标,450 nm处的OD读数为纵坐标,绘制3种细胞的增殖曲线,观察DDX1对神经母细胞瘤细胞增殖能力的影响。2.流式细胞仪观察细胞凋亡:将生长状态良好、处于对数生长期的SK-N-BE(2)/Blank、SK-N-BE(2)/sh V和SK-N-BE(2)/sh DDX1细胞接种于6孔板,每孔接种数目为3×105个细胞/孔,培养24 h后使用流式细胞仪PI染色检测SK-N-BE(2)/Blank、SK-N-BE(2)/sh V和SK-N-BE(2)/sh DDX1细胞的凋亡差异,观察DDX1对神经母细胞瘤细胞凋亡的影响。3.流式细胞仪观察细胞周期:将生长状态良好、处于对数生长期SK-N-BE(2)/Blank、SK-N-BE(2)/sh V和SK-N-BE(2)/sh DDX1细胞接种于6孔板,每孔接种数目为3×105个细胞/孔,培养24 h后使用流式细胞仪PI染色检测SK-N-BE(2)/Blank、SK-N-BE/sh V和SK-N-BE(2)/sh DDX1细胞各自位于G1、S、M、G2期的细胞比例,观察DDX1对神经母细胞瘤细胞周期的影响。结果:1.SK-N-BE(2)/shDDX1细胞增殖能力明显弱于SK-N-BE(2)/Blank和SK-N-BE(2)/sh V细胞,提示DDX1敲减后神经母细胞瘤细胞增殖能力减弱。2.SK-N-BE(2)/shDDX1细胞凋亡数目明显多于SK-N-BE(2)/Blank和SK-N-BE(2)/sh V细胞,提示DDX1敲减后神经母细胞瘤细胞凋亡增加。3.相对于SK-N-BE(2)/Blank和SK-N-BE(2)/sh V细胞,SK-N-BE(2)/sh DDX1细胞的细胞周期阻滞,细胞增殖能力下降。结论:抑制DDX1表达,可导致神经母细胞瘤的细胞周期受阻,增殖能力减弱,细胞凋亡增加。提示,DDX1表达与神经母细胞瘤的发生和发展密切相关。第四部分:DDX1对SK-N-BE(2)细胞侵袭、迁移及耐药能力的影响目的:探讨DDX1对神经母细胞瘤细胞侵袭、迁移及耐药能力的影响。方法:1.目的病毒及阴性对照慢病毒感染目的细胞:将细胞悬液接种于6孔细胞培养板中(3×105个细胞/孔),5%CO2 37℃培养箱中培养过夜。2.Transwell检测细胞迁移:用胰酶消化细胞,细胞计数,调整细胞浓度为5×108个/L;加入0.1 m L细胞悬液于小室中,同时在下层孔板中加0.6 m L完全培养基;用镊子将小室放到加有培养基的孔板中,置于培养箱中培养;每天观察迁移情况,48 h时停止培养;取出小室,去除小室中的上清,用棉签擦掉小室上层的细胞;吸取0.5 m L 4%多聚甲醛置于另一个干净的孔中,放入小室,室温固定15 min。3.结晶紫染色观察细胞迁移率:吸取1 mL洗涤液(Regent A)置于另一孔中,润洗小室。吸取1 m L染色液(Regent B)置于另一个孔中,放入小室进行染色,室温放置20 min。取1 m L Regent A置于步骤1的洗涤孔中,将小室放回洗涤孔中洗涤,直到Regent A无色时,显微镜下拍照。每个小室选取5个视野计数,计算细胞的侵袭率。在干净的孔中加入600μL的裂解液(Regent C),放入小室,37℃孵育20 min,直至呈蓝紫色澄清溶液,去掉小室,吸取100μL孔板中的溶液至于另一个清洁的孔板中。酶标仪检测570 nm处的OD值,计算细胞迁移率。4.细胞耐药对比观察:将生长状态良好、处于对数生长期SK-N-BE(2)/Blank、SK-N-BE(2)/sh V和SK-N-BE(2)/sh DDX1细胞接种于96孔板,每孔接种数目为6000个细胞,并设5个副孔。将药物加入细胞培养板,使阿霉素终浓度为1.0μg/m L,顺铂终浓度为2.5μg/m L。药物处理24 h后使用CCK-8试剂盒检测细胞数量。结果:1.SK-N-BE(2)/sh DDX1细胞侵袭能力明显弱于SK-N-BE(2)/Blank和SK-N-BE(2)/sh V细胞。提示敲减DDX1,能使神经母细胞瘤的细胞侵袭能力下降。2.SK-N-BE(2)/sh DDX1细胞迁移能力明显弱于SK-N-BE(2)/Blank和SK-N-BE(2)/sh V细胞。提示敲减DDX1,能使神经母细胞瘤的细胞迁移能力减弱。3.使用阿霉素和顺铂处理后,SK-N-BE(2)/sh DDX1的活细胞数明显低于SK-N-BE(2)/Blank和SK-N-BE(2)/sh V细胞。提示敲减DDX1,能够提高神经母细胞瘤细胞对阿霉素和顺铂等化疗药物的敏感性。结论:抑制DDX1表达,可降低神经母细胞瘤的细胞侵袭和迁移能力,并提高对于阿霉素和顺铂等恶性实体肿瘤主要化疗药物的敏感性。全文归纳:1.课题研究依据:儿童神经母细胞瘤的年发病率仅为0.3/10万~0.5/10万,但本课题仍在研究前期积累到5例初诊儿童病例,检测验证神经母细胞瘤确实存在DDX1高表达,使本研究获得尽可能充分的理论与实验依据。2.实验条件制备:成功建立DDX1基因敲减的SK-N-BE(2)细胞系,为本课题开展DDX1基因对神经母细胞瘤功能的影响研究,提供有效实验条件。3.研究结果归纳:通过细胞株对比研究发现,敲减DDX1,能使神经母细胞瘤细胞的细胞增殖受阻、增殖能力下降、肿瘤细胞的侵袭或迁移能力减弱,并可导致对阿霉素和顺铂等化疗药物的敏感性增加。均提示DDX1基因表达与神经母细胞瘤的发生和发展,以及临床预后等因素密切相关。为深入开展DDX1基因相关研究提供实验依据,以探索DDX1基因表达可能作为神经母细胞瘤临床诊治预后分析因素或治疗靶点的潜在价值。