【摘 要】
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本论文在水解角蛋白拟无枝酸菌Amycolatopsis keratiniphila HCCB10007中建立了CRISPR/Cas9技术,探索了该基因编辑系统的可编辑长度,并采用CRISPR/Cas9技术和基因过表达研究了VB12生物合成途径中不同来源的关键酶基因cobA的表达对相关次级产物代谢途径的影响,为该菌株的基因操作提供了新的高效方法。1.建立了A.keratiniphila HCCB10
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本论文在水解角蛋白拟无枝酸菌Amycolatopsis keratiniphila HCCB10007中建立了CRISPR/Cas9技术,探索了该基因编辑系统的可编辑长度,并采用CRISPR/Cas9技术和基因过表达研究了VB12生物合成途径中不同来源的关键酶基因cobA的表达对相关次级产物代谢途径的影响,为该菌株的基因操作提供了新的高效方法。1.建立了A.keratiniphila HCCB10007内CRISPR/Cas9基因编辑系统以A.keratiniphila HCCB10007万古霉素合成基因簇中的糖基转移酶gtfD为编辑对象设计sg RNA,构建了Cas9、sg RNA不同启动子组合的骨架质粒p KCCas9dgtfD-NA、p KCCas9EgdgtfD-NA、p KCp GCas9EgdgtfD-NA,并在此基础上构建了插入e GFP片段的gtfD基因同源臂的编辑质粒p LYNY02、p LYNY03、p LYNY04,结果显示Cas9启动子PGADPH和sg RNA启动子Perm E*的编辑质粒p LYNY04能成功地发挥作用,CRISPR/Cas9基因编辑后的A.keratiniphila HCCB10007突变株菌丝体能观察到GFP绿色荧光;该启动子组合敲除gtfD（约1.2kb）的编辑质粒p LYNY04以及敲除gtfD、gtfE、vas C、Lmb E（约5.5kb）的编辑质粒p LYNY05均成功电转入A.keratiniphila HCCB10007;发酵结果显示质粒p LYNY04阻断了A.keratiniphila HCCB10007中万古霉素生物合成。2.内源性cobA的过表达与外源性cobA的CRISPR/Cas9编辑构建来源于A.keratiniphila HCCB10007的内源性cobA过表达质粒p LYNY01,电转化入A.keratiniphila HCCB10393,获得的工程菌株中VB12分支代谢途径的粪卟啉III合成显著降低,推测内源性cobA发挥了分流作用;选取VB12高产好氧菌脱氮假单胞菌P.denitrificans SC510的cobA,使用CRISPR/Cas9方法构建外源性cobA敲入质粒p LYNY06,电转化入出发菌株A.keratiniphila HCCB10393,获得外源性cobA敲入菌株A.keratiniphila LYNY06-10393。与出发菌株对比,工程菌株的粪卟啉III合成稍降低,表明外源cobA也起到了一定的分流能力但功效小于内源性cobA,并且也证明了CRISPR/Cas9质粒可以在该菌株中发挥作用。
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