神经系统遗传病是由于生殖细胞或受精卵遗传物质的数量、结构或功能改变,使发育的个体出现以神经功能缺损为主要临床表现的疾病。神经系统遗传性疾病是人类所有遗传性疾病中非常重要的一类,也是神经系统疾病和医学遗传学的重要组成部分,在所发现的遗传性疾病中约占半数以上。神经系统遗传病病种繁多,而且大都具有家族性和终身性的特点,但是不少疾病的病因和发病机制尚未阐明。有研究表明,神经系统遗传病可在任何年龄发病,但是大多数神经系统遗传病的发病年龄在30岁之前。目前大多数神经系统遗传病尚无有效的治疗方法,致畸、致残及致死率高,危害极大且预后不良,严重影响患者的生活质量。大多数遗传病仍主要以预防为主,因此,做好遗传咨询、产前诊断,预防患儿的出生就变得尤为重要。近年来,随着人类基因组草图的完成,神经系统遗传病在致病基因定位、克隆、基因及基因产物诊断和治疗等方面取得了突破,为神经遗传病的研究提供了更多方法和途径。腓骨肌萎缩症又称Charcot-Marie-Tooth病(CMT),也被叫做遗传性运动感觉周围神经病,是一组遗传异质性极强的周围神经系统遗传病。该组疾病是遗传性周围神经病最常见的类型,发病率为1/2500。腓骨肌萎缩症属于累及神经轴索和髓鞘的神经遗传病,病理改变以神经轴索的脱髓鞘和变性为主。遗传性痉挛性截瘫(Hereditary spastic paraplegias, HSPs)是一组具有明显临床及遗传异质性的神经系统遗传病,临床上以进行性的双下肢肌张力增高、肌无力和剪刀步态为主要特征,发病率为2-10/10万。遗传性痉挛性截瘫与腓骨肌萎缩症类似,两者同属于累及神经轴索的神经系统遗传病。其病理改变以上运动神经元的轴索变性和脱髓鞘为主,主要累及脊髓内长的上、下行纤维束(皮质脊髓束及背束),尤其是纤维束的远端。二者的区别在于遗传性痉挛性截瘫主要累及的是上运动神经元的轴索,而腓骨肌萎缩症主要累及下运动神经元的轴索,同时感觉神经也不同程度地受累。遗传性痉挛性截瘫和腓骨肌萎缩症在发病机制上存在着交叉重叠,因此,研究这两种疾病的发病机制对于理解神经轴索正常功能的维持具有极其重要的意义。在本研究中,我们利用在山东采集到的两个家系,对上述两种神经遗传病进行了分子遗传学的研究,检测了相关的致病基因并鉴定了突变类型。相关致病基因的鉴定和分离,为揭示上述疾病的发病机制奠定了基础。同时,还为两家系下一步的遗传咨询及产前诊断提供了保障,从而在一定程度上预防患儿出生,达到提高人口素质的目的。第一部分　一X连锁腓骨肌萎缩症家系致病基因的突变分析腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth disease, CMT)也被叫做遗传性运动感觉周围神经病((?)lereditary motor and sensory neuropathies,HMSN),是一组遗传异质性极高的周围神经系统受累的神经遗传病,其临床表现呈缓慢进展地上、下肢远端肌肉的进行性肌无力和萎缩,尤以双下肢远端的肌肉受累较重：足部肌肉萎缩可见爪形足、内翻马蹄足、垂足等畸形；病情严重者可见小腿和大腿下1/3肌萎缩而呈现典型的“鹤腿”样或倒立的香槟酒瓶状畸形,伴有肢体远端不同程度的感觉障碍和腱反射减弱或消失,少数患者出现可逆性或持久性的中枢神经系统受累。该病的发病率为1/2500,遗传方式可为常染色体显性遗传(AD)、常染色体隐性遗传(AR)、X连锁显性遗传(XD)或X连锁隐性遗传(XR)。患者发病较早,大多数忠者在20岁以前发病。根据腓骨肌萎缩症的病理和电生理特点,将其分为两型：Ⅰ型(脱髓鞘型)和Ⅱ型(轴索型)。Ⅰ型(脱髓鞘型),即CMT1,病理改变以周围神经脱髓鞘为主,表现为节段性脱髓鞘和髓鞘再生、施旺细胞增生形成“洋葱球”样改变；神经传导速度下降明显,正中神经运动传导速度(median motor nerve conduction velocity, MNCV)<38米/秒(m/s)；Ⅱ型(轴索型),即CMT2,病理改变以周围神经轴索变性为主；神经传导速度正常或者接近正常≥38m/s。另有研究表明,部分CMT家系患者的MNCV在25-45m/s之间,称之为中间型CMT (CMTDI)。CMT1A是常染色体显性遗传的Charcot-Marie-Tooth病最为常见的类型,占CMT患者的40%-50%,PMP22是其致病基因。PMP22基因编码一种髓鞘蛋白,该基因的重复突变是导致CMT1A最常见、最主要的致病原因,此外少数为点突变。X连锁的Charcot-Marie-Tooth病(CMTX)在CMT患者中占到了10%-20%；其中,90%以上的CMTX,即CMTX1型,是由GJB1基因突变所致的。GJB1基因位于Xq13.1,编码一种32KD的间隙连接蛋白CONNEXIN32,组成间隙连接通道介导相邻细胞间的离子、小分子营养物质交换及信号分子传递,该蛋白在周围神经的施旺细胞和中枢神经的少突胶质细胞中均有表达。我们在山东省发现了一个含有5代的CMT家系,家系中共有12名成员有症状且均为男性,该家系无男传男现象,女性携带者没有症状,初步考虑该家系患者为CMTX型。我们对该家系进行了临床分析、相关辅助检查,并采集了14人的DNA样本。随后,我们利用候选基因克隆的分析方法,首先对GJB1基因全部编码序列进行了扩增及sanger测序,发现该家系的突变基因为GJB1基因,该基因的c.614A>G(p.Asn205Ser)突变国外已有报道但国内尚未见报道。该错义突变使碱基发生转换(c.614A>G)并导致第205位的氨基酸由天冬酰胺变为丝氨酸。生物信息学分析提示该突变造成了CX32蛋白功能异常。该突变的发现,使给该家系提供遗传咨询与产前诊断服务成为可能。第二部分一常染色体显性遗传性痉挛性截瘫家系致病基因的鉴定我们在山东威海地区发现了一个遗传性痉挛性截瘫的大家系。该家系共有四代,其中包括4名患者。家系中的患者具有遗传性痉挛性截瘫的典型症状,发病年龄均为45岁左右。该家系中男女均有发病,女性患者多于男性。家系中连续几代均有发病患者,且存在无症状携带者。通过系谱分析,我们考虑该遗传性痉挛性截瘫家系的遗传方式为最常见的常染色体显性遗传。经详细的临床调查,该遗传性痉挛性截瘫家系的临床特点总结如下：①患者均发病较晚(45岁左右)；②病情进展缓慢；③临床症状差异较大,同时家系中存在完全不表现症状的携带者(考虑可能是尚未达到发病年龄)；④无遗传早现现象；⑤主要表现为进行性双下肢肌张力增高、肌无力、步态不稳和剪刀步态；⑥头部MRI、胸腰椎CT、肌电图等检查均未见明显异常；根据遗传性痉挛性截瘫的诊断标准,可以确诊该家系为单纯型遗传性痉挛性截瘫。在取得该家系样本后,我们首先采用连锁分析的方法,对已知的最常见的个单纯型常染色体显性遗传性痉挛性截瘫的致病基医]—SPASTIN (SPAST)基因进行了分析。我们分别在该基因位点附近选择紧密连锁的2个微卫星DNA多态位点—D2S2351、D2S2347,这两个位点分别位于基因的上游0.2Mb和下游0.9Mh,通过对微卫星DNA多态位点进行基因分型和计算LOD scpre值,排除或确定该基因为家系的致病基因。该家系在D2S2351立点不存在多态性；D2S2347位点与SPASTIN基因表现出一定的迮锁关系,所计算的LOD值为2.635,提示该基因与表型呈现一定程度的共分离。随后我们利用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)及测序的方法对先证者进行了SPAST基因的检测。结果发现先证者在该基因的第15外显子内存在一个14bp内杂合缺失(c.1630-1643delTACTCAGA),该位点的碱基缺失导致移码突变引起终止密码子的提前出现,从而导致翻译提前终止(p.tyr544profsX28)。随后,我们对家系其他成员进行测序,结果发现家系中所有已发病患者均携带该缺失突变,在家系中这一新突变与疾病表型共分离。另外我们还发现家系中的两位年轻个体也携带该缺失突变但是并未表现出临床症状。我们推测可能是由于尚未达到发病年龄因而没有疾病表型。同时,我们也利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法对家系中所有成员及50名正常对照的相应位点进行了分析,验证了上述结果,也排除了该突变为一多态位点的可能。我们又利用TA克隆技术进一步准确分离并测序了含有该缺失突变的DNA片段,这也更有利的证实了以上的实验结果。经查询人类基因突变数据库(HGMD),证实该突变为一新突变。该缺失突变(c.1630-1643delTACTCAGGAAGTGA)导致SPASTIN蛋白的翻译提前终止(p.tyr544profsX28),因此,我们推测该家系的致病机制可能为单倍体剂量不足。综上所述,本研究对两个与神经轴索变性和脱髓鞘相关的神经遗传病家系的致病基因进行了鉴定：GJB1基因的错义突变c.614A>G(p. Asn205Ser)是腓骨肌萎缩症家系的致病突变,该突变国外已有报道但是国内尚未见报道,为国内报道的新突变；一个新的SPAST基因的缺失突变(c.1630-1643delTACTCAGGAAGTGA)导致HSP家系成员致病,该缺失导致移码突变,引起终止密码子的提前出现,导致蛋白翻译提前终止(p. tyr544profsX28),该突变国内外均未见报道。这些研究结果扩充了疾病的突变谱,为疾病的筛查提供了依据；为了解腓骨肌萎缩症和遗传性痉挛性截瘫的发病机制奠定了良好的基础；对于研究其他神经退行性疾病也具有重要的参考价值。同时,这两种致病基因突变的鉴定与分离为两个家系中患者下一步的遗传咨询和产前诊断提供了条件；也为预防患儿出生及提高人口质量提供了保障。