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研究背景:膀胱癌发病率居泌尿系恶性肿瘤的首位,系泌尿系统常见的恶性病变。在全身恶性肿瘤中,其中男性膀胱癌发病率位居第七位,女性发病率排在第十位以后。膀胱癌具有多中心、易复发、易侵袭、易耐药等肿瘤生物学特点,10%~30%的NMIBC进展为MIBC,高级别的NMIBC更容易进展,近75%的高级别NMIBC,诊断后10年内出现肿瘤复发、进展或导致死亡。目前尚无有效手段和技术准确评估肿瘤预后。近年来发现的基质金属蛋白酶抑制因子-4(Tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP-4)具有抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移的能力。TIMP-4是基质金属蛋白酶抑制因子TIMPs家族成员中的一种,是基质金属蛋白酶MMPs的天然抑制剂。TIMP-4在多种恶性肿瘤组织及细胞中低表达,如子宫内膜癌、肝细胞癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌,肺癌、脑胶质瘤等。且现有研究表明该基因具有调控细胞增殖、凋亡和肿瘤血管的形成等生物学行为的功能,在多种肿瘤细胞中上调TIMP-4的表达可有效抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移。但到目前为止尚无TIMP-4关于膀胱癌的相关报道。目的:1.明确膀胱癌组织及癌旁正常组织中TIMP-4蛋白表达水平,统计分析表达水平有无差异,初步探讨TIMP-4与膀胱癌组织学分级之间的关系。2.通过构建TIMP-4过表达质粒,探讨过表达TIMP-4后对膀胱癌T24细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。方法:1.膀胱癌组织及癌旁正常组织中TIMP-4蛋白表达水平检测采用免疫组织化学染色法对152例膀胱尿路上皮癌(BUCC)患者手术标本进行SP染色,BUCC组织标本作为实验组,癌旁正常膀胱组织作为对照组。在显微镜下观察组织切片染色情况,运用半定量法分析膀胱癌组织及癌旁正常膀胱组织中TIMP-4蛋白的表达情况,并进一步分析其表达与膀胱癌组织学分级之间的关系。2.TIMP-4对膀胱癌T24细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响研究将实验中转染P-CMV4-TIMP-4质粒、P-CMV4空质粒及未转染T24细胞分别定义为实验组、对照组及空白组。收集三组细胞并提取蛋白与RNA后通过Western-blot和qRT-PCR技术检测三组细胞TIMP-4蛋白和信使RNA(Messenger RNA,mRNA)的表达情况,鉴定上调TIMP-4的效果。并进一步通过MTT实验和平板克隆形成实验检测并比较上调TIMP-4表达后T24细胞的增殖能力变化;Transwell实验和划痕实验检测上调TIMP-4表达后T24细胞的侵袭和迁移能力变化。结果:1.膀胱癌组织及癌旁正常膀胱组织中TIMP-4蛋白的表达水平运用SP法检测发现:BUCC组织TIMP-4蛋白染色阳性比率为26.97%,癌旁正常膀胱组织TIMP-4蛋白染色阳性比率为84.21%,经χ~2检验P<0.05,其差异具有统计学意义;在低级别膀胱乳头状尿路上皮癌与高级别膀胱乳头状尿路上皮癌组织中TIMP-4蛋白染色阳性比分别为38.71%和18.89%,经χ~2检验P<0.05,两者阳性表达率差异具有统计学意义(P<0.05)。2.TIMP-4对膀胱癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响通过质粒转染后收集不同组细胞蛋白及RNA,利用Western-blot检测,结果显示实验组T24/TIMP-4细胞的TIMP-4蛋白表达量比对照组及空白组增高。qRT-PCR检测结果显示:实验组TIMP-4 mRNA相对表达量比对照组及空白组增高。膀胱癌细胞增殖、侵袭和迁移检测结果提示:经分析实验组T24/TIMP-4细胞系、对照组和空白组细胞增殖生长曲线得知T24/TIMP-4细胞增殖能力弱于对照组及空白组(P<0.01);平板克隆形成实验显示实验组克隆形成能力显著下降;划痕实验结果可见实验组T24细胞的迁移能力较对照组、空白组均明显减弱(P<0.01);Transwell实验中实验组T24/TIMP-4细胞穿透小室数为(6.67±2.11)少于对照组(15.43±4.22)及空白组(13.23±3.23)(P<0.01)。结论:TIMP-4蛋白在BUCC组织及癌旁正常膀胱组织中均表达,前者比后者表达量降低。在BUCC组织中TIMP-4的表达水平与膀胱癌组织学分级相关,高级别组较低级组明显减少。通过转染P-CMV4-TIMP-4质粒能有效上调T24细胞中TIMP-4的表达,进一步MTT、平板克隆、划痕及Transwell实验结果提示上调TIMP-4表达后T24细胞的增殖能力及迁移侵袭能力均减弱。