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神经干细胞是一类具有分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞潜能，并能自我增殖的多能干细胞。神经干细胞研究为治疗神经系统疾病开拓了广阔的前景，但它要成功应用于临床，则要取决于其定向诱导分化和疾病局部微环境对神经干细胞的影响的研究。 表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)和碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是研究最为广泛、深入的神经干细胞增殖分化诱导因子，除了具有促增殖作用外，它们在不同培养条件下还能诱导神经干细胞向终末方向分化。雌激素、维甲酸(retinoic acid，RA)是神经系统正常发育所必须的两种因子，提示它们在神经干细胞分化诱导方面可能也发挥着重要作用。 β淀粉样蛋白(Amyloid Peptidy,Aβ)是淀粉样蛋白前体蛋白(amyloid precusor protein，APP)异常代谢产生的含有39—43个氨基酸残基的疏水肽，可聚合成不溶的纤维形式或不定型颗粒状结构，导致各种毒性反应，在阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)发病中起着至关重要的作用。AD的毒性也可为许多因子如雌激素等所拮抗，因此它们在AD的治疗中发挥着重要作用。 本实验从胚胎大鼠脑中分离出神经干细胞，进行体外培养，随后观察了EGF、bFGF、17—β雌二醇、全反式维甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)分别对神经干细胞分化的诱导作用；另外，用Aβ的毒性片段Aβ25—35干预神经干细胞，并加入雌激素的活性形式17—β雌二醇，观察Aβ对神经干细胞的毒性和雌激素的保护作用，为神经干细胞治疗AD进行了积极的探索。 材料与方法 从胎龄14天的SD大鼠全脑中分离出神经干细胞，以EGF和bFGF(各20ng／ml)为有丝分裂原，无血清体外培养。随后进行以下实验：郑州大学2003年硕士研究生毕业论文A p 25-35对胚胎神经干细胞的毒性和雌激素的保护作用1.神经干细胞鉴定及增殖能力检测培养8天后，取部分细胞，5一嗅·2-脱氧尿昔(5一Bromo一2一deox梦uridine，Brdu)标记，2天后进行nestin及BrdU免疫细胞化学染色，鉴定神经干细胞及其增殖能力。2.神经干细胞诱导分化培养14天后，取部分细胞加入终浓度为10%的胎牛血清，分为五组，再分别加入以下因子:对照组;EGF组，加入EGF( 20ng/ml);bFGr组，加入bFGF(Zong/ml);雌激素组，加入17一p雌二醇(10一，mol几);维甲酸组，加入AfRA(l umof几)。继续培养4天，随后进行MAPZ、GFAP免疫细胞化学染色分别观察诱导分化结果。3.体外培养14天后，取部分细胞，加入不含bFGF仅含EGF(20n留ml)的无血清培养基，分为三组:对照组;Ap25一35毒性组加入20umol/的凝聚态A目25一35:雌激素保护组同时加入Zoumolz的凝聚态A p 25一35和10一7mo比17一p雌二醇。以上三组细胞继续培养，并于第6、12、24、36、48小时台盼兰染色，计数细胞死亡率。48小时后，各组细胞进行以下实验:TUNEL法凋亡形态学检测;R不PCR检测bel一2、bax的mRNA表达;BrdU、GFAP、MAPZ免疫细胞化学染色检测神经干细胞增殖分化。实验结果1.神经干细胞鉴定及增殖能力检测培养十天后，所有细胞均为nestin阳性细胞;BrdU免疫细胞化学染色可见阳性细胞存在。2.神经干细胞诱导分化对照组几乎无GFAP、MAPZ阳性细胞，而EGF、bFGF、雌激素、ATRA诱导组均可见GFAP、MAPZ染色阳性的分化细胞。此外，各诱导因子作用组GFAP、MAPZ染色阳性细胞率无明显差别。3.A日25一35对神经干细胞的毒性及雌激素的保护作用 3.1 A p25一35和A日25一35+雌激素作用后神经干细胞死亡率变化 加入Ap25一35后，细胞死亡率明显上升，且呈时间倚赖性。12小时至 36小时之间，死亡率上升最快:36一48小时，死亡率几乎不再上升，稳定在60%左右。联合加入17一p雌二醇后，细胞死亡率显著降低。二.2 A p25一35和A p25一35+雌激素作用后凋亡形态学检测 对照组几乎未见凋亡细胞;雌激素保护组可见凋亡细胞，但比例少于Ap毒性处理组;Ap毒性组凋亡细胞阳性率高达40%。3.3 A p 25一35和A p 25一35+雌激素作用后凋亡相关基因bcl一2，bax表达郑州大学2003年硕七研究生毕业论文A p 25-35对胚胎神经卜细胞的毒性和雌激素的保护作用对照处理组bel一2、bax均无表达;雌激素保护组bel一2及bax均有表达;Ap毒性组仅有促凋亡基因bax表达，而无凋亡抑制基因be卜2表达。3.4 A p25一35和A p 25一35+雌激素作用后细胞增殖能力检测对照组神经干细胞Brdu阳性细胞率约为50%;雌激素保护组及Ap毒性组Brdu几乎未见阳性细胞。3.5 A p 25一35和A p25一35+雌激素作用后细胞分化检测。 MAPZ染色:对照组和雌激素保护组均可见MAPZ阳性细胞:Ap毒性组则未见MAPZ阳性细胞; GFAP染色:对照组、Ap毒性组、雌激素保护组均可见GFAP染色阳性细胞。结论1.EGF、bFGF和雌激素、全反式维甲酸在含血清培养基中均可促进神经干细胞向神经元、星形胶质细胞方向分化。2.A p 25一35在体外能抑制神经干细胞增殖，促进凋亡，其促凋亡作用与诱导促凋亡基因bax表达有关;此外，Ap25一35在体外能抑制神经干细胞向神经元方向