凤香型白酒特征微量成分表征及其对酒精性肝损伤的影响探究

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白酒是中国传统的固态发酵酒精饮料,在中国已有几千年的酿造历史,是中华历史文化发展的见证。此外,白酒作为一种嗜好品,深受众多消费者喜爱,承载着重要的经济价值。现有研究表明:白酒中约含98%的水和乙醇,2%的微量成分,且白酒中微量成分种类繁多,目前已经被报道的有两千多种。同时研究还发现,白酒中2%左右的微量成分不仅决定了白酒的风格特点,也包含了许多对人体健康有益的生物活性物质。然而目前已有的研究,就研究对象而言,大部分集中在浓香型、酱香型等基础香型或特色鲜明的小众香型,对陕西特色凤香型白酒的报道较少;就研究内容而言,主要关注于白酒挥发性微量成分中的关键风味物质表征,缺乏对白酒全谱微量成分的系统性研究;再者,在对白酒微量成分中的活性物质研究方面,目前大多是利用单一活性物质标准品进行体外或体内活性研究,对全酒中所有微量成分在协同作用下的功效研究尚不深入。基于此,本研究以凤香型旗帜西凤(QZXF)白酒为主要研究对象,通过与西方蒸馏酒(威士忌、伏特加、朗姆酒、金酒、白兰地)和中国四大基本香型白酒(清香型汾酒、浓香型五粮液、酱香型茅台、米香型桂林三花)对比,利用不同前处理手段结合气相色谱-质谱法(gas chromatographic-mass spectrometer,GC-MS)和超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱(ultrahigh-performance liquid chromatography and electrospray ionization quadrupole Orbitrap high-resolution mass spectrometry UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS)等技术对酒样中的微量组分进行系统性非靶向全谱检测,并利用多元统计分析筛选出凤香型QZXF白酒区别于其他蒸馏酒样的特征微量成分,并在此基础上,利用QZXF全酒进行细胞试验和动物试验,探究凤香型QZXF全酒中所有微量成分在协同作用下对酒精性肝损伤的影响。具体研究内容包括以下四个部分:(1)基于UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS表征凤香型白酒中的特征微量成分。首先,利用直接进样法结合UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS对10种不同类型蒸馏酒进行检测,然后通过多元统计分析结合峰面积比值分析筛选出基于UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS检测的凤香型白酒的特征微量组分。定性结果显示:利用直接进样法结合UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS在凤香型QZXF白酒中共定性出946种微量成分;PCA和PLS-DA结果均显示,不同蒸馏酒样组内内聚程度较好,且凤香型白酒能与其它蒸馏酒样明显分开,表明与其他蒸馏酒样相比,凤香型白酒中存在潜在的差异微量成分;进一步数据分析发现凤香型QZXF白酒中的甜菜碱、胆碱、别嘌呤醇、腺苷、腺嘌呤、D-(+)-脯氨酸含量远高于其他蒸馏酒样,被筛选为基于UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS检测的凤香型白酒特征微量成分;最后,通过进一步优化色谱条件,对凤香型QZXF成品酒中6种特征微量成分进行定量,别嘌呤醇含量最高(591.34μg/L),其次是胆碱(269.30 μg/L),接下来分别是D-(+)-脯氨酸(103.73 μg/L),甜菜碱(78.03 μg/L),腺苷(20.28 μg/L),腺嘌呤(10.83 μg/L)。(2)基于GC-MS表征凤香型白酒中的特征微量组分。首先,利用涡旋辅助液液微萃取(VA-LLME)结合GC-MS检测蒸馏酒样中的挥发性微量成分,利用MSTFA衍生化结合GC-MS检测蒸馏酒样中的难挥发性微量成分;然后通过多元统计分析结合峰面积比值分析筛选出基于GC-MS检测的凤香型白酒中挥发性特征微量组分和难挥发性微量成分。定性结果表明:在凤香型QZXF白酒中定性出挥发性微量成分118种,难挥发性微量成分58种;挥发性微量成分和难挥发性微量成分多元统计分析结果均显示:凤香型QZXF组内聚集良好,组间能明显与其他蒸馏酒样分开,表明凤香型白酒中存在潜在的差异微量成分;进一步数据分析筛选出凤香型QZXF白酒中挥发性特征微量成分有5种,分别是2-乙酰基呋喃、3-羟基-2-2 丁酮、丙醇、5-甲基-2-乙酰基呋喃和1,3-二叔丁基苯,难挥发性特征微量成分有5种,包括2种难挥发性有机酸类物质(D-(+)-苹果酸、羟基乙酸)和3种糖类化合物(D-果糖、D-葡萄糖、D-来苏糖)。(3)细胞试验探究凤香型白酒微量成分对酒精性肝损伤的影响。分别建立酒精诱导人正常肝细胞LO2损伤模型和甜菜碱修复模型,并以细胞内活性氧水平(ROS)、丙二醛(MDA)含量等指标来表征甜菜碱对酒精性肝损伤细胞的影响,结果表明:酒精浓度3%是LO2细胞乙醇损伤的最佳浓度,以此建立损伤模型;且在模型组的基础上添加不同浓度的甜菜碱干预后,细胞内的ROS含量、ALT、AST泄漏量以及MDA含量显著降低(p<0.05),GSH含量显著上升(p<0.05),且呈现明显的剂量依赖性,这些指标均说明甜菜碱在一定浓度基础上可以缓解酒精诱导的LO2细胞损伤。由于甜菜碱在白酒中的含量较低,考虑到甜菜碱的“量效关系”以及白酒中多种微量成分间的“协同效应”,接下来以凤香型QZXF全酒为研究对象,以无水乙醇和食用酒精为对照,观察凤香型QZXF全酒、无水乙醇和食用酒精对人正常肝细胞LO2损伤程度差异,MTT、ALT、AST等指标均表明:QZXF组的肝细胞LO2损伤程度显著低于无水乙醇和食用酒精组,这说明了 QZXF白酒中甜菜碱等不同微量成分间可能具有协同增效作用,从而在一定程度上缓解酒精对肝细胞的损伤。(4)研究凤香型QZXF全酒干预对小鼠肝损伤程度和肠道菌群的影响。给昆明小鼠饲喂低(0.93 mL/kg/d)、中(2.80 mL/kg/d)、高(4.66 mL/kg/d)剂量的食用酒精和凤香型QZXF白酒12周,通过小鼠的表型指标、生理生化指标及肝脏切片来比较食用酒精(Alcohol)和QZXF白酒对小鼠肝损伤的影响差异,并基于16S rRNA高通量测序对小鼠肠道菌群结构进行分析,探究QZXF全酒对小鼠肝损伤的影响机制。小鼠表型指标、生化指标,肝脏病理切片结果均表明:凤香型QZXF全酒和Alcohol均会使小鼠产生不同程度肝损伤,但对比同等剂量的Alcohol,QZXF全酒对小鼠肝脏的损伤程度均较低,表明QZXF全酒中的微量组分在协同作用下可以拮抗酒精引起的肝损伤;小鼠血清乙醇浓度和肠道菌群结构分析结果表明:凤香型QZXF白酒中的微量组分对酒精性肝损伤的拮抗作用不是通过增强肝脏分解代谢乙醇的能力实现的,可能是通过调节小鼠肠道菌群结构实现的;门水平和属水平上小鼠肠道菌群结构分析结果表明:长期摄入酒精会导致小鼠肠道菌群发生显著变化,具体表现为拟杆菌门(Bacteroidetes)菌群相对丰度显著增加,厚壁菌门(Firmicutes)、变形杆菌门(Proteobacteria)等菌群相对丰度显著降低,但QZXF组与Alcohol组肠道菌群结构在门水平上无显著性差异;其差异主要体现在属水平上对Polyangia菌属、P-unidentified-Bacteria;c-Bacteroidia菌属等的调节作用。综上,本研究表征了凤香型白酒中的特征微量成分并探究了凤香型白酒中的微量成分对酒精性肝损伤的影响,一方面可以在一定程度上填补不同香型白酒研究中凤香型白酒的研究空白;另一方面,可以让更多人认识并了解凤香型白酒及其活性功效,为人们健康饮酒提供科学引导,同时也为凤香型白酒的质量控制和标准化生产提供科学依据,有助于推进凤香型白酒的高质量发展。
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