严重烧伤或创伤后皮肤组织的病理性愈合可导致增生性瘢痕的形成,其主要表现为突出皮面、形状不规则的红色硬质斑块。增生性瘢痕不仅影响外观,对患者造成严重的心理伤害,还可挛缩导致受伤部位发生功能障碍,影响患者的生活质量。尽管对于创面愈合的认识不断加深,但是增生性瘢痕的发生机制仍未完全阐明,临床上也没有有效的预防和治疗措施。随着人们对形象和生活质量追求的不断提高,增生性瘢痕的治疗与预防成为近年来的研究热点。大量研究表明增生性瘢痕的主要病理改变是细胞外基质的过度沉积,而皮肤(肌)成纤维细胞对细胞外基质的合成和降解有重要的调节作用。在创面愈合的过程中,皮肤成纤维细胞大量增殖,并分化为肌成纤维细胞,合成以Ⅰ型胶原为主要成分的细胞外基质,一旦细胞外基质的合成和降解的平衡被打破,即可造成细胞外基质过量沉积。因此研究影响(肌)成纤维功能的分子及其作用机制对于增生性瘢痕形成机制的认识尤为关键。TGF-β1是多种器官纤维化过程中的关键细胞因子,在创面愈合过程中表达增高,并对(肌)成纤维细胞的功能产生重要的调节作用,促进皮肤成纤维细胞的增殖、分化,促进(肌)成纤维细胞合成大量细胞外基质,并抑制胶原降解酶类的合成,而使细胞外基质大量沉积。而我们课题组前期通过基因芯片等实验发现P311在增生性瘢痕中的表达明显高于正常皮肤,提示P311在创面愈合以及增生性瘢痕的形成过程中可能发挥着重要作用。在此基础上,我们以P311为切入点,通过酵母双杂交和荧光共振能量转移技术筛选出真核启动因子6(eukaryotic initiation factor 6,eIF6)是P311的胞内相互作用蛋白。在随后的研究中,我们又发现eIF6减少可以促进TGF-β1的转录启动,而加TGF-β1的表达量,进而通过TGF-β1-Smad信号通路促进肌成纤维细胞的分化,最终促进增生性瘢痕的形成。于是,下一步我们想探究eIF6的相互作用蛋白——P311,在增生性瘢痕的形成以及肌成纤维细胞的分化过程中的调节作用,以及与TGF-β1是否存在联系。因此,为了探究成纤维细胞中P311和TGF-β1的相互作用关系,及其对成纤维细胞功能的影响,本实验以P311野生型和基因敲除型新生小鼠皮肤成纤维细胞为目标展开研究。研究内容和方法1、P311腺病毒表达载体及对照载体的构建、包装、扩增、纯化和滴度测定将本实验室前期构建的pDsRed-P311质粒双酶切后,与穿梭质粒pAdTrack连接,将穿梭载体转化至感受态大肠杆菌DH5α,鉴定筛选阳性克隆,并进行质粒的扩增和提取。将线性化的穿梭质粒pAdTrack-CMV-P311和pAdTrack-CMV分别转化至含pAdEasy-1的感受态大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,酶切鉴定成功后,在HEK293细胞中进行病毒的包装、扩增,应用相应试剂盒进行病毒的纯化和滴度测定。2、新生小鼠原代皮肤成纤维细胞的分离培养及基因型的鉴定取P311野生型和P311基因敲除型C57BL/6新生小鼠各5只,消毒、清洗后断颈处死,分离皮肤并剪块,在0.5g/l DispaseⅡ中浸泡过夜,分离出真皮组织后剪碎,加入0.5%胰蛋白酶溶液37℃消化10min,终止消化后离心获得细胞及组织沉淀,接种于培养瓶中37℃细胞培养箱培养,定时换液、传代,采用第2代成纤维细胞完成本实验,每个实验重复3次。对剪取的鼠尾利用试剂盒提取基因组DNA,通过P311相关引物进行PCR扩增鉴定相应的基因型。3、P311过表达对成纤维细胞TGF-β1、α-SMA及Ⅰ型胶原表达的影响取P311野生型成纤维细胞,按照随机数字表法分为对照组和P311过表达组,分别加入等量的空载腺病毒和P311腺病毒表达载体。两组成纤维细胞培养48h后,采用实时荧光定量RT-PCR法和蛋白质印迹法分别检测两组成纤维细胞的TGF-β1、α-SMA和Ⅰ型胶原mRNA和蛋白的表达量。4、P311基因敲除对成纤维细胞TGF-β1、α-SMA及Ⅰ型胶原表达的影响取P311野生型和P311基因敲除型成纤维细胞,待培养至细胞密度为80%～90%时,采用实时荧光定量RT-PCR法和蛋白质印迹法检测两种成纤维细胞的TGF-β1、α-SMA、Ⅰ型胶原的mRNA和蛋白的表达量。5、TGF-β1对成纤维细胞中P311mRNA和蛋白水平表达的影响将P311野生型成纤维细胞饥饿处理后,按照随机数字表法将细胞分为6组,分别加入浓度为0、5、10、15、20和25ng/ml的TGF-β1,继续培养48h,采用实时荧光定量RT-PCR法检测6组成纤维细胞的P311的mRNA表达量;免疫荧光法检测空白对照组和10ng/mlTGF-β1组成纤维细胞的P311蛋白表达。6、TGF-β1对P311野生型和基因敲除型成纤维细胞α-SMA和Ⅰ型胶原表达的影响将P311野生型成纤维细胞饥饿处理后,按照随机数字表法将细胞分为空白对照组和10ng/mlTGF-β1组两组,分别加入浓度为0和10ng/ml的TGF-β1,继续培养48h后,采用实时荧光定量RT-PCR法和蛋白质印迹法检测两组成纤维细胞的α-SMA和Ⅰ型胶原的mRNA和蛋白的表达量。取P311基因敲除型成纤维细胞,同前分组、处理及检测指标。研究结果1、P311腺病毒表达载体及对照载体的构建、包装、扩增、纯化和滴度测定经过多步的酶切和PCR鉴定,成功构建了 P311腺病毒表达载体和对照空载体,在HEK293细胞中包装、扩增,再进行纯化后,测定滴度为109PFU/ml。2、新生小鼠原代皮肤成纤维细胞的分离培养及基因型的鉴定顺利分离、培养了 P311野生型和基因敲除型新生小鼠皮肤成纤维细胞。基因型鉴定结果表明,小鼠的基因型与预期相一致。3、P311过表达对成纤维细胞TGF-β1、α-SMA及Ⅰ型胶原表达的影响P311过表达组的成纤维细胞之P311mRNA表达水平较空载体对照组的成纤维细胞增高近30万倍(t=9.942,P<0.001)。P311过表达组的成纤维细胞之TGF-β1、α-SMA和I型胶原的mRNA,以及TGF-β1前体、TGF-β1活化态、α-SMA、Ⅰ型胶原的蛋白表达量均较空载对照组的成纤维细胞明显升高(t值为8.192～49.090,P值均小于0.001)。4、P311基因敲除对成纤维细胞TGF-β1、α-SMA及Ⅰ型胶原表达的影响P311基因敲除型成纤维细胞的TGF-β1、α-SMA、Ⅰ型胶原的mRNA表达量较P311野生型成纤维细胞明显降低(t值为8.157～22.270,P值均小于0.01)。P311基因敲除型成纤维细胞的TGF-β1前体、α-SMA、Ⅰ型胶原的蛋白表达量较P311野生型成纤维细胞明显降低(t值为2.995～12.600,P值均小于0.05),两组成纤维细胞的TGF-β1活化态蛋白表达量无明显差异(t=1.070,P>0.05)。5、TGF-β1对成纤维细胞中P311mRNA和蛋白水平表达的影响空白对照组及5、10、15、20和25ng/mlTGF-β1组的成纤维细胞之P311mRNA表达量分别为 1.28±0.44、3.61±0.91、6.64±0.92、6.58±1.04、1.79±0.31、0.16±0.06。与空白对照组的成纤维细胞比较,10ng/ml和15ng/mlTGF-β1组的成纤维细胞的P311mRNA表达量明显增高(t值分别为5.630和4.710,P值均小于0.001);25ng/mlTGF-β1组的成纤维细胞之P311mRNA表达量明显降低(t=2.509,P<0.01)。5、20ng/mlTGF-β1组的成纤维细胞之P311mRNA表达量与空白对照组的成纤维细胞相近(t值分别为2.302和0.955,P值均大于0.05)。10ng/mlTGF-β1之P311荧光明显强于空白对照组成纤维细胞。6、TGF-β1对P311野生型和基因敲除型成纤维细胞α-SMA和Ⅰ型胶原表达的影响10ng/mlTGF-β1组的P311野生型成纤维细胞的α-SMA、I型胶原的mRNA和蛋白表达量均较空白对照组明显升高(t值为3.523～14.290,P<0.05或P<0.01)。10ng/mlTGF-β1组的P311基因敲除型成纤维细胞的α-SMA、Ⅰ型胶原的mRNA和蛋白表达量均较空白对照组P311基因敲除型成纤维细胞有不同程度的升高(t值为4.895～14.870,P<0.05或P<0.01)。P311野生型成纤维细胞施以外源性TGF-β1处理后,α-SMA表达的增加量高于P311基因敲除型成纤维细胞,而Ⅰ型胶原表达的增加量则相近。结论1、P311可以促进皮肤成纤维细胞的分化以及细胞外基质的合成,并促进TGF-β1的表达;2、TGF-β1可以促进皮肤成纤维细胞的分化以及细胞外基质的合成,并对P311的表达水平存在浓度依赖性的双向调节,即低浓度促进P311的表达,高浓度则有明显的抑制作用。3、P311和TGF-β1在皮肤成纤维细胞中存在相互作用关系,而这种相互作用关系可通过调节成纤维细胞的功能,在创面愈合和增生性瘢痕形成的过程中发挥重要作用。