研究背景子宫内膜异位症是生育期女性的常见病,且近年来有上升趋势；本病在病理上呈良性形态学表现,但具有类似恶性肿瘤的特性：种植、侵袭及远处转移,是当今严重威胁妇女健康的妇科主要疾病之一。异位子宫内膜的来源至今尚未阐明,目前主要学说有：子宫内膜种植学说、淋巴及静脉播散学说、体腔上皮化生学说、诱导学说、遗传学说、免疫调节学说、其他因素(包括环境因素、血管生成、凋亡减少等)。其中种植学说是被绝大多是学者接受的,但是在位子宫内膜是如何种植到子宫腔以外的部位的目前尚不明确。子宫内膜异位症是一个有侵袭能力的良性疾病,侵袭有三部曲：迁徙、粘附和血管形成。在子宫内膜异位症中,关于在位内膜和异位内膜的粘附和血管形成的研究较多,目前尚无子宫内膜异位症迁徙方面的研究。子宫内膜异位症的发生是一个不断进展的过程,如何预防疾病的复发已经成了一个国际性难题。这使得从疾病发生之初阻断异位内膜的种植尤为关键。因此,揭示子宫内膜种植过程中子宫内膜细胞迁徙的分子机制对防治子宫内膜异位症的发生具有重要的意义。细胞迁徙是机体内重要的生理过程,它是由离子通道调控的,涉及到细胞肌动蛋白的动力和形态的快速改变、·细胞粘附位点的重新分布。细胞内存在一套完整、严密的机制以调控细胞的迁徙。细胞的迁徙可以分解成三个步骤：细胞的前沿伸出伪足,肌动蛋白网收缩,引导细胞迁徙的方向；未聚合的激动蛋白随伪足运动,形成新的肌动蛋白,伪足与底物结合产生新的粘附；尾部的胞体粘附分离,细胞向前移动；尾部的激动蛋白收缩,胞体向前移动。细胞迁徙发生的原因与细胞体内渗透压的改变有关。引起细胞体内渗透压的改变需要大量水分子的参与。目前关于细胞迁徙与子宫内膜异位症的发生的研究较少。长期以来普遍认为,细胞内外的水分子是以简单的跨膜扩散方式透过脂质双分子层。1988年,Agre等在鉴定人类Rh血型抗原时,偶然在红细胞膜上发现了一种新的28ku跨膜蛋白。1991—-1992年,Agre等又先后完成了该蛋白分子克隆和功能鉴定,并证实该蛋白具有明确的水转运功能。随后,在许多动、植物及微生物中相继发现类似的专一性运输水的通道,统称为水通道蛋白(aquaporin,AQP)。研究表明AQP家族有着广泛的功能：促进水分子的快速被动运输；调节细胞内外渗透压的平衡；促进细胞迁徙；调节脂肪代谢；神经信号传导等。在女性生殖器官中的子宫、卵巢、输卵管部位,卵泡的排卵、月经的形成以及恶性肿瘤或具有恶性行为的良性妇科疾病的发生发展都涉及到液体的流动以及宫腔或卵泡腔容积的改变。在女性的在位子宫内膜细胞上已经发现有AQP的表达,我院前期的研究发现,AQP1,2,8在在位子宫内膜上有表达,AQP5在卵巢癌上皮细胞上有表达；但迄今AQP在异位子宫内膜细胞上的研究尚未见相关报道。由于本院前期的研究已经证明AQP1,2,8在正常妇女的子宫内膜上有表达,尚无水通道蛋白在子宫内膜异位症中的研究。本研究首先检测子宫内膜异位症患者的在位子宫内膜和异位子宫内膜的AQP1,2,5,8的表达情况,以探讨水通道蛋白在子宫内膜异位症的子宫内膜中的表达定位；结果发现,AQP1在在位内膜和异位内膜的微血管上有表达,AQP2,5,8在在位内膜和异位内膜的腺细胞上均有表达。AQP1、2、4、5、8是选择性运输水分子的水通道蛋白,由于本院对AQP1在正常子宫内膜微血管、子宫内膜增殖症以及子宫内膜癌中已有研究,文献报道AQP2、8主要是在分泌细胞上表达,本研究发现,AQP2、5、8在有分泌功能的子宫内膜腺上皮细胞上有表达,目前尚无AQP5在分泌细胞上的研究。本研究首先检测子宫内膜异位症患者的在位和异位内膜的AQP1,2,5,8的表达情况,以探讨AQP1,2,5,8在异位子宫内膜中的定位；然后以AQP5为切入点,应用RNA干扰技术沉默AQP5基因,观察干扰后子宫内膜腺细胞AQP5的表达及其干扰后细胞迁徙的改变；旨在阐明细胞迁徒与子宫内膜异位症发生的关系,并寻找能阻断子宫内膜迁徙的关键分子,为探索子宫内膜异位症的防治提供实验依据。第一章AQP1,2,5,8蛋白在子宫内膜异位症在位和异位内膜组织中的表达研究目的分别检测子宫内膜异位症患者的在位内膜和异位内膜的AQP1,2,5,8的表达水平,初步探讨水通道蛋白的表达与子宫内膜异位症的发生、发展的关系。材料和方法选取2004年10月至2007年9月在浙江大学医学院附属妇产科医院病理科存档的,因子宫内膜异位症进行半根治手术或术中诊刮的内膜,获得符合条件的病例共70例。根据纳入标准获得70例患者的异位内膜及在位内膜的石蜡标本。实验组为异位子宫内膜,对照组为同一例患者的在位内膜,通过免疫组织化学的方法检测AQP1,2,5,8蛋白的表达情况。结果1.AQP1在在位内膜和异位内膜的微血管中有丰富表达,在间质细胞和腺细胞中无表达；在在位子宫内膜组中,AQP2,5,8蛋白的表达主要位于子宫内膜的腺上皮和腔上皮细胞；AQP2在间质中无表达,AQP8在间质中有少许表达,AQP5在间质中有较弱的表达；在异位子宫内膜中,AQP2,5,8的表达主要在腺上皮和腔上皮细胞,在间质中的表达略高于在位内膜。2.在两组中,AQP1,2,5,8的表达与月经周期有关,在增生早期的表达较弱,增生晚期和分泌期的表达较强。3.光密度分析AQP1在分泌期的异位内膜的表达高于在位内膜；半定量分析AQP2,5,8在在位内膜的表达显著高于异位内膜上的表达(P=<0.001,P=0.004,P<0.001)；4.AQP1,2,5,8在在位内膜和异位内膜的表达在增生期和分泌期无显著性差异。结论AQP1,2,5,8在子宫内膜上的过表达可能参与子宫内膜异位症的发生。第二章干扰AQP5基因对子宫内膜腺细胞迁徙的影响研究目的探讨AQP5基因对子宫内膜腺细胞的迁徙的影响,从而明确迁徙相关水通道蛋白基因对子宫内膜腺细胞迁徙的影响。材料和方法通过RNA干扰(RNAi)技术沉默子宫内膜癌腺细胞株Ishikawa中AQP5基因,Realtime-PCR检测干扰后mRNA水平的抑制,免疫印迹检测干扰后腺细胞中AQP5蛋白表达的改变；细胞穿孔实验检查干扰后腺细胞的迁徙能力的改变。结果1.AQP5 RNA干扰后,干扰组子宫内膜腺细胞AQP5 mRNA及蛋白表达水平明显降低,有统计学差异(P分别为0.03,0.007),而阴性对照组与空白对照组之间的mRNA及蛋白表达水平改变无统计学差异(P>0.05)。2.AQP5 RNA干扰后,RNA干扰组子宫内膜腺细胞的细胞迁徙数目显著下降(P<0.05)；阴性对照组与空白对照组间上述细胞穿过数的改变均无统计学差异。结论1.通过RNA干扰能成功沉默子宫内膜腺细胞中的AQP5基因；2.下调AQP5基因的表达可抑制子宫内膜腺细胞的迁徙,推测AQP5基因可影响子宫内膜腺细胞的迁徙。