论文部分内容阅读
宣威火腿、金华火腿、如皋火腿是我国著名的三大传统干腌火腿,其发酵周期约在6个月以上,火腿在长时间腌制发酵过程中,火腿的内源性蛋白酶会降解肌肉蛋白质产生大量游离氨基酸以及肽类物质,这些水解产物可能具有功能活性。本实验室前期研究表明金华火腿及宣威火腿等干腌火腿中存在抗氧化肽及降血压肽,而关于干腌火腿活性肽的抗菌特性研究国内还未有报道。本论文首先比较分析了宣威火腿、金华火腿、如皋火腿粗肽提取物的抗氧化及抑菌活性;选取其中抗氧化及抑菌活性最强的宣威火腿粗肽提取物进行抑菌稳定性等方面的研究,同时通过分离纯化得到宣威火腿中存在的高效抗菌肽段。主要研究内容和结论如下:1.三种中国传统干腌火腿中粗多肽抗氧化及抑菌活性的比较研究本章探讨了宣威火腿、金华火腿、如皋火腿粗多肽的体外抗氧化活性及抑菌活性。研究表明:在三种干腌火腿中,宣威火腿粗多肽中肽含量最高(67.67±4.65%),含盐量最低(7.46±0.68%)。在抗氧化能力方面,宣威火腿粗肽液铁离子还原能力、ABTS+自由基清除能力和氧自由基清除能力均显著高于其他两种干腌火腿(P<0.05);在2.0 mg/mL时,宣威火腿粗肽液清除DPPH自由基的能力显著弱于其他两种干腌火腿(P<0.05),在5.0 mg/mL时宣威火腿粗肽液清除能力达43.40±2.67%,显著高于如皋火腿(P<0.05)。在抑菌能力评价方面,在0.5到1.5 mg/mL浓度范围内,宣威火腿及如皋火腿粗肽液抑制0157型大肠杆菌能力显著高于金华火腿(P<0.05);在4.0 mg/mL时,宣威火腿及如皋火腿粗肽液抑制单增李斯特菌能力显著高于金华火腿(P<0.05)。氨基酸分析表明宣威火腿粗肽提取物Leu、Val、Pro、Ala和Trp等疏水性氨基酸含量较高,达到8.06 g/100g,显著高于其他两种干腌火腿(P<0.05),一定程度上解释了宣威火腿粗肽较高的抗氧化及抑菌活性。2.宣威火腿粗多肽抑菌活性稳定性及抑菌作用研究本章研究了宣威火腿粗多肽在不同处理条件下抑制0157型大肠杆菌的稳定性及宣威火腿粗多肽对0157型大肠杆菌及单增李斯特菌细胞通透性的影响。实验结果表明,温度显著影响宣威火腿粗多肽的抑菌能力,在25到40℃温度范围内,宣威火腿粗肽液抑菌能力有所上升,在40℃时抑菌能力达到最高(43.71±4.12%),显著高于其他温度节点(P<0.05);在40-80°℃温度范围内,随温度上升,宣威火腿粗肽液抑菌能力下降。当保持40℃的温度环境,随着加热时间增加,宣威火腿粗肽液抑菌能力会逐渐降低,其中0、5、10、15 min时间点没有显著差异(P>0.05)。此外,酸性及碱性条件均对宣威火腿粗肽液的抑菌能力有一定的影响,pH为7时的宣威火腿粗肽液抑菌能力最高,显著高于pH为3和11时的抑菌能力(P<0.05)。在紫外照射条件下,抑菌活性得到加强,照射60 min后抑菌能力趋于稳定,抑菌效果(63.07±4.68%)显著高于未经过紫外处理组(P<0.05)。通过FCM分析及核酸、蛋白质流失实验可知,宣威火腿粗肽液对0157型大肠杆菌及单增李斯特菌细胞的细胞膜都具有破坏作用,而粗肽液处理时间长短对细菌细胞膜渗透性影响较小。碱性磷酸酶含量的实验说明宣威火腿粗肽提取物可以影响细菌细胞壁的完整性,并且浓度越高破坏作用越强,且粗肽液对0157型大肠杆菌的破坏作用强于单增李斯特菌。3.宣威火腿抗菌肽的分离纯化及肽序列鉴定本实验部分通过离子交换色谱、尺寸排阻色谱对宣威火腿粗肽提取物进行分离及脱盐,并测定分离得到的各个组分的抑菌活性。经测定,组分7抑制0157型大肠杆菌能力(98.72±1.17%)及单增李斯特菌能力(56.74±4.91%)最强,显著高于其他组分(P<0.05)。故选取活性最高的组分,通过Nano-LC-ESI-MS/MS肽序列鉴定,得到抑菌活性最强的三条肽段,分别为QYYNGEEHVRFDSDVGEYR、LRNLPNLEVLDLGTNFI、FASFEAQGALANIAVDK。经合成验证后,三条肽段均具有较强的抑制0157型大肠杆菌和单增李斯特菌的能力,其中,三条肽段抑制0157型大肠杆菌能力没有显著差异,而QYYNGEEHVRFDSDVGEYR抑制单增李斯特菌能力显著强于 LRNLPNLEVLDLGTNFI 和 FASFEAQGALANIAVDK。