【摘 要】
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背景在重组药物蛋白表达系统中,中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary,CHO）是最常用的哺乳动物表达细胞系,被批准的重组蛋白70%来自于CHO细胞。瞬时基因表达（Transient gene expression,TGE）具有成本低、周期短、操作简单等优点,不仅是生物药物开发早期阶段的重要工具,而且在科研中被广泛使用。但瞬时基因表达存在质粒易丢失、表达量低等问题。有研究表明,
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背景在重组药物蛋白表达系统中,中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary,CHO）是最常用的哺乳动物表达细胞系,被批准的重组蛋白70%来自于CHO细胞。瞬时基因表达（Transient gene expression,TGE）具有成本低、周期短、操作简单等优点,不仅是生物药物开发早期阶段的重要工具,而且在科研中被广泛使用。但瞬时基因表达存在质粒易丢失、表达量低等问题。有研究表明,在CHO细胞中,通过共表达特定基因能提高重组蛋白生产力。目的探究CHO细胞中共转p21CIP、p18、PDI、XBP-1s、p21CIP+p27KIP、p18+a FGF、PDI+Bcl-x L和XBP-1s+ERO1-Lα基因对重组蛋白表达的影响。方法1.共转载体构建及共转比例优化通过无缝克隆技术构建含有p21CIP、p18、PDI、XBP-1s、p21CIP+p27KIP、p18+a FGF、PDI+Bcl-x L和XBP-1s+ERO1-Lα基因的共转载体,并进行酶切鉴定。将含增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescence protein,eGFP）基因的载体作为目的载体,通过脂质体转染法以目的载体:共转载体质量比为2:1、5:1、10:1、15:1的比例分别转染CHO细胞;悬浮培养第7天收集细胞,流式细胞术检测eGFP的表达水平。2.共转基因对eGFP表达的影响及机制通过脂质体转染法,以优化的最佳比例（10:1）将eGFP与共转基因共转染CHO细胞。细胞转染48 h,荧光显微镜观察eGFP表达情况。悬浮第7天收集细胞,流式细胞术、Western Blot和q PCR检测eGFP的表达量。细胞悬浮培养的第1、3、5、6、7天检测活细胞密度（Viable cells density,VCD）以及细胞活力;悬浮培养第4天进行细胞周期检测;悬浮第7天进行细胞凋亡检测。3.共转基因对重组蛋白阿达木抗体及VTN表达的影响将表达阿达木抗体或玻连蛋白（Vitronectin,VTN）的载体与共转载体以10:1的比例共转染CHO细胞。无血清悬浮培养第7天收集上清,ELISA检测阿达木抗体和VTN在CHO细胞中的表达情况。结果1.成功构建了8个含不同共基因的共转载体。以2:1的比例共转染时,XBP-1s将eGFP表达水平提高了1.34倍,其余未见明显提高;以5:1的比例共转染时,p21和p18+a FGF将eGFP表达水平提高了1.13倍,其余未见明显提高;以15:1的比例共转染时,PDI、XBP-1s、p21+p27和p18+a FGF将eGFP表达水平分别提高了1.13、1.16、1.23和1.14倍,其余未见明显提高;以10:1的比例共转染时,共转基因都提高了eGFP表达水平,提高倍数为1.43～2.02倍;优化出最佳转染比例为目的质粒:共转质粒为10:1。2.以10:1的比例共转染目的基因eGFP和8个共转基因,eGFP的表达水平分别提高了1.72、1.81、1.67、1.54、1.51、2.02、1.43和1.79倍,且eGFP表达水平和m RNA表达水平无显著相关性;共转染p21、p18、p21+p27和p18+a FGF使G1期细胞百分比分别提高了6.19%、4.52%、5.27%和2.26%;共转染PDI、XBP-1s将VTN蛋白氧化形式与还原形式的比值分别提高了1.14和1.4倍。3.p21、XBP-1s和PDI+Bcl-x L将阿达木抗体的表达水平分别提高了1.32、1.31、1.57倍;PDI、XBP-1s和p21+p27将VTN的表达水平分别提高了1.22、1.19、1.34倍。结论p21、XBP-1s和PDI+Bcl-x L的过表达提高了阿达木的表达量,另外PDI、XBP-1s和p21+p27的过表达提高了VTN的表达水平。其余共转基因未明显提高重组蛋白的表达。p21和p21+p27提高转基因表达可能与细胞周期阻滞及抑制细胞生长有关;PDI和XBP-1s基因提高蛋白表达可能与促进蛋白的氧化折叠有关。
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背景自全面施行“二孩政策”以来,我国剖宫产率在不断提高。有研究显示,我国剖宫产率高居世界第一,各城市普遍在40%以上,个别地区剖宫产率甚至高达80%,远高于世界卫生组织（WHO）建议的10%～15%。疼痛作为术后最严重的并发症,日益引起临床工作者的重视。近年来,随着新型镇痛药物及镇痛技术的应用,极大地改善了患者术后疼痛问题,但是仍有很大一部分患者的术后疼痛缓解效果不佳,特别是剖宫产手术患者,术后疼
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