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金黄色葡萄球菌(S.aureus)是一种可以引起人和动物多种疾病的重要致病菌,其生长需要的铁来源于感染宿主的血红蛋白。IsdB蛋白是S.aureus铁利用过程中所必须的血红蛋白受体,在S.aureus中具有高度保守性。研究表明IsdB对小鼠和猕猴均有良好的免疫原性,且产生的抗体水平显著高于其它表面蛋白。因此,研究IsdB蛋白的免疫原性,利用IsdB的铁结合机制来发展人和动物抗S.aureus疫苗将具有重要的实践价值和理论意义。本研究首先采用PCR方法扩增了50株奶牛乳房炎S. aureus分离株的isdB基因,确定isdB基因在我国牛源S.aureus中的保守性。然后对S. aureus菌株BMSA/855/23-1的isdB基因PCR扩增片段进行了纯化回收,克隆到pMD18-T载体上。经测序后,与GenBank已知序列对比分析。进一步克隆到pQE-30表达载体上,转化大肠杆菌XL1-Blue,IPTG诱导后,SDS-PAGE鉴定IsdB融合蛋白的表达。应用纯化的IsdB融合蛋白和全菌体灭活菌苗分别免疫小鼠,Western-Blot检测重组蛋白的特异性抗体结合活性。建立间接ELISA方法,检测蛋白组及全菌体组小鼠血清中IgG抗体水平;应用微量凝集试验检测IsdB蛋白免疫血清对13株奶牛乳房炎S.aureus不同地方分离株的交叉凝集反应;应用MTT和ELISPOT方法检测加强免疫后第10d蛋白组小鼠的T淋巴细胞转化效果及脾淋巴细胞中细胞因子IFN-γ的水平。在二免后第14d用不同S.aureus菌株对蛋白免疫组进行攻毒,用BMSA/855/23-1对全菌体免疫组进行攻毒,评价IsdB蛋白的免疫保护效果。结果在50株S. aureus分离株中均扩增出了isdB基因,证明该基因在我国牛源S.aureus中是高度保守的。重组克隆pMD18-T-isdB经测序后,与GenBank上S. aureus MW2株的核苷酸及氨基酸序列一致性均为98.8%。SDS-PAGE结果表明,重组质粒pQE-30-isdB在E. coli XL1-Blue中成功表达。Western Blot检测表明重组蛋白具有较好的抗原性。蛋白组及全菌体组小鼠血清中抗IgG抗体水平在加强免疫第三周均达到最高值(1:64 000);微量凝集试验结果表明IsdB蛋白抗血清与12个菌株产生了特异性的凝集反应,证明IsdB蛋白抗血清具有与不同分离株产生抗原抗体反应的能力。T淋巴细胞转化试验结果显示免疫组与对照组相比差异显著(p<0.05);ELISPOT检测蛋白组细胞因子IFN-γ的水平与对照组相比,显著升高(p<0.05),表明IsdB蛋白能刺激小鼠产生较好的细胞免疫应答。攻毒试验结果表明蛋白免疫组对S.aureus菌株BMSA/855/23-1、SH-12和SH-16的保护率分别为80%、80%和50%,全菌体组对BMSA/855/23-1的保护率为80%。综上所述,isdB基因在我国牛源金黄色葡萄球菌中具有高度保守性,表达的重组IsdB蛋白具有较好的免疫原性及免疫保护作用,可以作为疫苗的抗原应用于防制S. aureus感染。