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鸡毒霉形体（Mycoplasma gallisepticum,MG）是鸡慢性呼吸道病（Chronicrespiratory disease,CRD）和火鸡传染性窦炎（Infectious sinusitis）的主要病原菌。该病的实验室诊断方法主要有病原的分离鉴定、免疫学方法、分子生物学方法等,病原的分离鉴定是诊断MG感染最可靠的方法,但病原分离存在操作复杂、工作量大、时间长等缺点。免疫学方法有血清平板凝集试验（SPA）、血凝抑制试验（HI）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光抗体技术等。这些方法虽然简便易行,但大多只是对抗体做出检测,不能用于MG早期感染和隐性感染的检测,且存在非特异性反应和交叉反应性,所以并不能对MG感染做出快速准确的诊断。聚合酶链式反应（PCR）、核酸探针等分子生物学方法可检测抗原,但这些方法对试验设备和人员素质有很高的要求,目前还难以广泛推广和应用。本研究制备了鼠抗MG单克隆抗体和兔抗MG多克隆抗体,建立了针对MG抗原的间接夹心ELISA检测技术,为鸡毒霉形体病的快速诊断提供了一种新的检测方法,取得了如下结果。1.兔抗MG多克隆抗体的制备将经纯化的MG-HS菌液接种于FM-4固体平板上,37℃培养7～10d,取出后在40×显微镜下观察其菌落形态,呈典型的荷包蛋状菌落,将MG-HS菌液扩大培养并离心,洗涤沉淀4次,制成100倍浓缩菌悬液,测定蛋白浓度为18mg/ml,所得悬液与弗氏佐剂乳化后免疫家兔,得到兔抗MG的高免血清,其琼扩效价达到1:32,经饱和硫酸铵粗提、G-200过柱纯化后,经SDS-PAGE电泳鉴定其纯度,呈典型的IgG条带,为MG抗原检测间接夹心ELISA诊断方法的建立奠定了基础。2.MG单克隆抗体的制备与纯化将制成的100倍浓缩菌悬液调节浓度至2mg/ml,与弗氏佐剂乳化后免疫BALB/c小鼠,待小鼠血清的ELISA抗体效价达1:10000以上时,将小鼠脱颈椎处死制备免疫脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经过2轮细胞融合、多次筛选和克隆,最后获得2株针对MG的且能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞（287和6G9）。染色体数目分别为86.6和86.9;经小鼠腹腔接种后收获腹水,287细胞株的间接ELISA效价为1:5.12×105,6G9株的间接ELISA效价为1:2.56×105,且均不与其它禽类呼吸道病原发生交叉反应;用间接ELISA方法对2株单抗的相对亲和力进行鉴定,结果表明287的亲和力高于6G9。说明这2株单抗特异性强,灵敏度高,可用于MG抗原的ELISA检测。3.检测MG抗原的间接夹心ELISA方法的建立以纯化的兔抗MG IgG为第一抗体包被酶标板,鼠抗MG单克隆抗体为第二抗体,结合羊抗鼠IgG-HRP,通过对ELISA反应条件的优化选择,建立了检测MG抗原的间接夹心ELISA法。方阵滴定的结果表明,兔抗MG IgG的最佳工作浓度为1μg/mL,鼠抗MG单克隆抗体的最佳工作浓度为5μg/mL;用所建立的间接夹心ELISA方法对30份健康鸡气管拭子材料进行了检测,将阴性样品取平均OD450值,再加上3倍标准差即OD450+3S（0.054+3×0.023=0.123）定为阴、阳结果判定临界值。但考虑到临界值与阴性值太接近,故最终将阴、阳性结果的临界值定为0.2;对已知的不同浓度梯度的MG培养液进行检测,结果表明该方法所能够检测的MG抗原的浓度下限为5×101cfu/ml,即待检样本中含有50个菌体既能被检测为阳性;板内变异系数为0.41%～6.72%;板间变异系数为0.88%～10.72%。说明该方法的敏感性高,重复性好,很有可能成为鸡毒霉形体感染的一种常规的快速检测方法。