[目的]急性髓细胞性白血病（acute myeloid leukemia，AML）是血液系统常见的恶性肿瘤，发病机制至今尚未完全明了，分类标准、治疗方法及预后判断指标在不断地修正。随着白血病相关基因的不断发现，检测这些基因作为白血病预后判断与微小残留病灶的指标正受到更多的关注。人FLT3基因（FMS样酪氨酸激酶3，FMS-like tyrosine kinease 3）是Ⅲ型受体酪氨酸激酶（Receptor Tyrosine Kinase，RTK）家族成员的原癌基因，其蛋白产物属于细胞受体，定位于细胞膜上。在正常人骨髓中，FLT3的mRNA表达仅限于CD34+干／祖细胞，该受体与多种胞浆蛋白作用，介导一系列细胞内信号传导，导致细胞增殖和分化。在白血病细胞中FLT3和配体（Flt3 ligand，FL）共表达导致自分泌和旁分泌环路，可能与急性白血病恶性克隆的增殖和维持有关。内部串联复制（internal tandem duplication，ITD）是近年来在AML患者中发现的FLT3基因最常见的一种突变类型，各种类型的FLT3／ITD均表现为配体非依赖性磷酸化，通过Ras和STAT5途径介导细胞转化。一些临床研究表明其表达可能与高白细胞、高原始细胞和预后差相关。由于FLT3突变与白血病发生密切相关，促使科学家们不断探寻选择性FLT3抑制剂，以期作为FLT3相关性白血病的靶向治疗手段。本研究主要以初发AML患者作为研究对象，检测其FLT3 mRNA表达水平、测定FLT3主要突变体FLT3／ITD的突变率、分析它们与化疗疗效及预后的关系。[材料与方法]1．病人资料：AML病例数共129例，诊断依照张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》。其中男性63例，女性66例，中位年龄42岁（11～83岁）。129例中，初发AML患者80例，其中M0型8例，M1型8例，M2型25例，M3型20例，M4型6例，M5型13例。部分缓解期患者13例，完全缓解期患者36例。10例正常人骨髓作为对照。2．方法：（1）实时荧光定量PCR方法检测FLT3 mRNA表达水平：Trizol一步法抽提骨髓单个核细胞总RNA，逆转录反应制备cDNA，FLT3及β-actin的引物及探针设计参考文献，常规PCR扩增6例FLT3阳性初治AML患者的逆转录产物，构建扩增产物的重组质粒，提取质粒，制备阳性标准品，应用德国罗氏公司的LightCycler荧光定量PCR仪，日本Takara公司的Premix Ex Taq^TM定量PCR试剂盒扩增，将重组质粒系列十倍比稀释后建立标准曲线，应用已建立的实时荧光定量PCR方法，患者cDNA与标准品同时行定量PCR，每次实验均设立β-actin内对照，FLT3与β-actin转录产物的绝对拷贝数之比，作为FLT3 mRNA表达水平，用于分析。（2）RT-PCR方法检测FLT3／ITD突变：Trizol一步法抽提骨髓单个核细胞总RNA，逆转录反应制备cDNA，应用美国MJ公司的PTC-200型常规PCR仪进行扩增，20g／L琼脂糖凝胶电泳，PCR产物电泳条带在凝胶成像分析系统下观察并拍照。（3）基因组PCR方法检测FLT3／ITD突变：Gentra提取DNA试剂盒制备基因组DNA，应用PTC-200型常规PCR仪进行扩增，20g／L琼脂糖凝胶电泳，PCR产物电泳条带在凝胶成像分析系统下观察并拍照。（4）细胞免疫表型检测：采用活细胞直接免疫荧光法标记，流式细胞仪检测初发AML患者白血病细胞免疫表型，髓系抗原采用CD13、CD33、CD14、HLA-DR、MPO，干／祖细胞标志采用CD34。（5）染色体核型分析：采用R显带法，核型异常的描述按照国际人类细胞遗传学命名体制[ISCN（1995）]。根据预后的好、中、差将染色体核型分为三组：1．预后较好，包括t（8；21），t（15；17）；2．预后中等，包括正常，+4，+8，+11，+21，del（9p）等；3．预后差，包括t（9；22）及复杂异常。3．统计学方法：常规进行方差齐性检验、正态性检验。单变量两组资料之间的比较采用t检验，多组资料之间的比较采用单因素方差分析，方差不齐者采用非参数检验，计数资料使用x²检验，以p＜0.05为差别有统计学意义。采用SPSS10.0统计处理软件分析。[结果]一、实时荧光定量PCR方法对FLT3基因的检测1．实时荧光定量PCR方法检测FLT3 mRNA表达水平我们应用实时荧光定量PCR方法检测了129例AML患者（包括80例初治AML患者、13例部分缓解期患者和36例完全缓解期患者）治疗前后共152份骨髓单个核细胞的FLT3 mRNA表达水平。对其中20例患者进行治疗前后动态检测。80例初治AML患者骨髓单个核细胞FLT3 mRNA表达水平中位数为0.1041（0～33.8736），而正常人骨髓单个核细胞FLT3 mRNA表达水平的中位数为0.0020（0.0006～0.0040），两者比较有显著差异（P=0.001）。6例未缓解患者中，FLT3表达水平为0.1033（0.0418～1.9872），15例部分缓解患者中，FLT3表达水平为0.0251（0～1.4091），未缓解者的FLT3表达水平显著高于部分缓解组，两者比较具有显著差异；51例完全缓解患者中（其中15例为治疗后获得完全缓解者），FLT3表达水平为0.0026（0～2.0579），显著低于初治组（P＜0.001），而与正常对照组相比无统计学差异（P=0.593）。2．FLT3基因在初治AML各亚型患者中的表达结果其中M0型为0.1367（0～10.1149），M1型为0.2029（0.0514～33.8736），M2型为0.0868（0～18.4587），M3型为0.0646（0.0012～7.6841），M4型为0.1251（0.0680～0.1714），M5型为0.1139（0.0002～26.2200），各亚型之间FLT3 mRNA表达水平差异无统计学意义（P=0.592）。3．初治AML患者的临床特征与FLT3 mRNA表达水平的关系80例初治AML患者FLT3表达水平与性别（男性38例，女性42例）、年龄无相关性（P＞0.05），与白细胞数（0.7×10⁹～440.5×10⁹）无相关性（P=0.430），与骨髓白血病细胞比例（73.1±15.4％）无相关性（P=0.268）。初治AML患者FLT3表达水平与HLA-DR、CD13、MPO、CD14、CD33、CD34抗原表达无相关性（P＞0.05）。FLT3表达水平与染色体核型无相关性（P=0.313）。二、AML患者FLT3基因突变的检测1．FLT3／ITD突变在AML中的表达80例初治AML患者应用RT-PCR技术检测FLT3／ITD突变，出现FLT3／ITD突变者共11名，占检测总人数的13.8％，均为杂合突变，其中M1型3例，M2型4例，M3型3例，M5型1例。在这80名患者中又有38例抽提DNA利用基因组PCR方法检测FLT3／ITD突变，其中5例FLT3／ITD突变阳性，33例FLT3／ITD阴性，与RT-PCR方法检测FLT3／ITD突变的结果完全一致。对其中3例异常条带进行纯化后克隆测序，证实为野生型FLT3／ITD突变（见附图1至附图3）。2．FLT3／ITD克隆测序分析我们对其中3例FLT3／ITD阳性标本进行测序分析，显示ITD主要位于外显子14，亦可累及内含子14和外显子15。各例ITD的复制区域不同，大小不等（21～42bp），但均为框内突变。例1在外显子14有42bp的复制区域，ITD为Y589Y591编码序列重复，例2在外显子14有21bp的复制区域，在外显子15亦有21bp的复制区域，而内含子缺失了21bp，例2 ITD的重复序列在Y599的下游，未涉及酪氨酸残基，例3在外显子14有30bp的复制区域，ITD为Y599编码序列重复。3．FLT3／ITD突变与FLT3 mRNA表达水平的关系FLT3／ITD阳性组的FLT3 mRNA表达水平为0.2200（0.0297～33.8736），FLT3／ITD阴性组的FLT3 mRNA表达水平为0.0975（0～26.2200），FLT3／ITD阳性组的FLT3 mRNA表达水平高于FLT3／ITD阴性组，但统计学分析差异无显著意义（P=0.066）。4．FLT3／ITD突变患者的临床特征FLT3／ITD阳性组的年龄均数为47岁，FLT3／ITD阴性组的年龄均数为44岁，两组无明显差异（P=0.593）。男性和女性发生突变的频率比为：1：1.3，但在统计学上无明显差异（P=0.638）。FLT3／ITD阳性组就诊时骨髓白血病细胞数为81.7±9.9％，FLT3／ITD阴性组骨髓白血病细胞数为71.3±16.2％，两组间有显著统计学差异（P=0.009）。FLT3／ITD阳性组患者就诊时白细胞计数中位数为74.9×10⁹／L，FLT3／ITD阴性组白细胞计数中位数为7.5×10⁹／L，两组间有显著性差异（P=0.001）。FLT3／ITD阳性组患者就诊时血红蛋白为102.8±28.9 g／L，FLT3／ITD阴性组患者血红蛋白为81.4±21.3g／L，两组间有显著性差异（P=0.005）。两组间血小板计数无显著性差异（P=0.476）。FLT3／ITD阳性组的MPO抗原阳性率（72.6±32.7％）高于阴性组（39.4±27.8％）。5．FLT3／ITD突变与患者FAB分型的关系FLT3／ITD突变在FAB亚型中的分布，M0型为0％（0／8），M1型为37.5％（3／8），M2型为16.0％（4／25），M3型为15.0％（3／20），M4型为0％（0／6），M5型为7.7％（1／13），其中M1型的FLT3／ITD阳性率最高，但统计学分析，各组间差异无显著性（P=0.254）。6．FLT3／ITD突变与细胞遗传学的关系80例初治AML患者中75例染色体检查可供分析。FLT3／ITD突变在各组的分布为：t（8；21）组16.7％（1／6），t（15；17）组12.5％（1／8），正常核型组15.1％（8／53），其它异常组0％（0／6），复杂异常组50％（1，2），各组间差异无统计学意义（P＞0.05）。三、FLT3基因表达水平及突变与疗效、预后的关系1．初治AML患者的治疗缓解率80例初治AML患者中可评价疗效的58例，其中12例M3患者接受了1个月以上的维甲酸或砷剂诱导治疗，CR率为83.3％，46例非M3患者接受联合化疗，一疗程CR率为50.0％。2．FLT3／ITD突变阳性AML与疗效的关系9例FLT3／ITD阳性患者2例早期死亡，早期病死率22.2％，49例FLT3／ITD阴性患者4例早期死亡，早期病死率8.2％，FLT3／ITD阳性患者早期病死率高于FLT3／ITD阴性患者，但统计学分析差异无显著意义（P=0.231）。在12例M3患者中，2例FLT3／ITD阳性患者均未缓解，而10例FLT3／ITD阴性患者均获得完全缓解，二者相比，差异有显著性（P=0.015）；在46例非M3患者中，7例FLT3／ITD阳性患者CR率为57.1％，39例FLT3／ITD阴性患者CR率为48.7％，统计学分析差异无显著性（P＞0.05），FLT3／ITD突变阳性的患者完全缓解后检测FLT3／ITD转阴性。3．FLT3 mRNA表达水平与治疗缓解率的关系由于M3患者的治疗及缓解率与其它AML不同，我们在分析中剔除了M3病例以分析FLT3 mRNA表达水平与治疗缓解率的关系。根据FLT3表达水平与正常上限（0.0040）的比值分组，表达水平低于正常上限10倍（0.04）的初治AML患者8例（低表达组）有7例获得完全缓解，CR率为87.5％，表达水平高于正常上限10倍的初治AML患者38例（高表达组）有16例完全缓解，CR率为42.1％，统计学分析两组差异有显著性（P=0.047）。四、实时荧光定量PCR方法监测FLT3 mRNA表达水平的动态变化追踪观察20例患者（2例M0、6例M2、11例M3、1例M5）治疗前后FLT3mRNA表达水平的动态变化，初发时均呈高度表达，12例获完全缓解，FLT3表达水平迅速或缓慢下降至少1个对数级别，甚至达到正常水平，2例获部分缓解，FLT3表达水平稍有下降（0.7761→0.0358，0.1128→0.0355），另外6例未缓解者FLT3表达水平无明显变化，甚至稍有升高。我们对1例CR患者进行了FLT3表达水平连续检测，发现其FLT3 mRNA表达一直维持在0.0020～0.0027的正常水平。[小结]1．初治AML患者FLT3 mRNA表达水平升高，经治疗缓解后FLT3基因表达下降，在完全缓解组其表达水平较低，与正常对照组无差别，而未缓解组FLT3表达水平与初治组无差别。不同FAB亚型AML患者的FLT3基因表达水平无差异。2．80例初治AML患者中11例FLT3／ITD突变阳性，阳性率13.8％，FLT3／ITD是目前AML人群中频率较高的一类突变，用基因组PCR方法与RT-PCR方法检测FLT3／ITD突变的结果一致，不同患者ITD特异性条带与野生型FLT3的间距不同，灰度比亦有明显差异。3．FLT3／ITD阳性组FLT3 mRNA表达水平高于FLT3／ITD阴性组，两组在性别、年龄组成方面差异无显著性，FLT3／ITD突变患者具有高白细胞数、高白血病细胞比例等临床特征。4．FLT3／ITD阳性患者早期病死率有高于阴性组的趋势。M3患者出现FLT3／ITD预后不佳，化疗缓解率低。FLT3／ITD阳性患者完全缓解后转阴性，因此，FLT3／ITD可以做为阳性患者的白血病微小残留病灶的检测标志。5．FLT3基因mRNA高表达的患者化疗缓解率低，预后不佳。FLT3基因mRNA可以作为AML疗效观察和预后判断的指标。实时荧光定量PCR方法对AML患者骨髓单个核细胞FLT3基因表达的定量分析，可作为AML患者治疗效果及预后判断的指标，也可以作为微小残留病的监测工具。6．FLT3 mRNA表达水平检测与FLT3／ITD突变检测可以互相弥补，更有利于对AML患者的预后判断。