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猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)所引发的一种急性、热性和致死性传染病。猪瘟标记疫苗(Marker Vaccine)具有区别猪瘟疫苗免疫抗体和野毒感染抗体的特点,可以用于净化及紧急免疫。近年来,陆续有国内外研究者应用分子生物学和基因工程方法,对猪瘟野毒或弱毒进行基因修饰构建出新毒株,其中以Erns和E2为基础构建新毒株的方法在猪瘟标记疫苗的研究中占据着重要地位。WH303单克隆抗体表位为线性表位,位于猪瘟的E2蛋白,突变后不能与相应的单克隆抗体反应,猪瘟C株为我国研发的具有良好安全性和免疫保护效果的疫苗毒株。故本研究在猪瘟兔化弱毒C株的基础上突变WH303表位构建猪瘟标记疫苗候选毒株。本研究通过自行设计引物IVDC582、IVDC583,运用重叠PCR的方法,扩增出了包含WH303最小识别序列在内的2047bp大小的片段;然后将该片段连接至T载体,得到MT-582583;再以限制酶SnaBI和NgoMIV酶切连接至实验室构建的质粒pMD18-T-NotI-BamHI和pMD18-T-NotIBamHI-flag;最后用限制酶NotI和BamHI酶切连接至C株和C-flag株的感染性克隆,从而完成突变毒株MC与MC-flag的感染性克隆构建。经体外转录成病毒RNA,利用电转的方法将MC株电转至PK15细胞,连续传代,使用单抗WH303和1C8对病毒液进行免疫组化染色,以确定MC株是否成功拯救。兔体接种C株和MC株,观测兔子体温变化情况。体温达到峰值时,对兔进行安乐死,取脾脏和其他主要器官,进行RT-PCR检测和测序,同时制备组织切片,通过免疫组化来确定MC株在兔体的增殖情况。在3d、7d、14d和21d四个时间段取兔全血,制备血清,进行酶联免疫吸附试验(ELISA),检测血清中抗体含量。通过重叠PCR的操作方法,成功筛选出M-297300阳性克隆;将M-297300连接至T载体得到MT-582583;通过酶切连接操作,成功构建出了pMD18-T-NotI-BamHI-582583M和pMD18-TNotI-BamHI-flag-582583M阳性质粒;再次酶切连接,最终构建成功了MC和MC-flag感染性克隆并拯救出了病毒株。在病毒MC传代的过程中免疫组化结果显示,在48h后、第六代和第十二代以单抗1C8进行免疫组化染色均为阳性,WH303染色为阴性,表明病毒成功拯救并稳定传代。MC株在兔体内传三代,MC接种兔体结果显示,在前两代中兔体发热情况不明显,第三代基本呈定型热反应。RT-PCR结果显示在第一代4只兔子中,只有一只出现目的条带,第二代和第三代全部出现目的条带,且测序结果均显示与引物IVDC582、IVDC583一致,说明在兔体传代的过程中突变毒株MC保持基因稳定。组织切片免疫组化染色的结果显示MC在脾脏和淋巴结内含量明显高于其他组织。接种MC株的兔血清阻断ELISA抗体检测结果为阴性,说明血清中没有特异性识别WH303位点的抗体;间接ELISA抗体检测结果为阳性,说明血清中存在猪瘟特异性抗体。本研究在C株的基础上突变WH303位点,在一定程度上避免了由强毒回复突变造成的生物安全隐患,而且突变毒株可以保持兔化弱毒C株的基本特性。再辅以后续研究的鉴别诊断方法,有望成为猪瘟标记疫苗。