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研究背景和目的缺血性中风(ischemic stroke)是一种常见且严重的疾病,其高致残率和高死亡率,严重危害着人类生命和健康。缺血伴随着缺氧,缺血缺氧性脑损伤的病理生理机制极为复杂,其中涉及的许多相关基因和蛋白的改变及其复杂的联系至今尚未完全研究清楚。曾经有学者通过脑缺血预处理实验发现脑缺血后可以激发内源性神经保护,促进新的蛋白质合成,从而阻止或减弱脑缺血引起的缺血性级联反应。鉴于目前对缺血性中风的治疗方法有限,溶栓疗法受时间限制,很多神经保护剂没有确切疗效,因此,寻找新的治疗靶点是我们的目标。我们的前期工作中发现细胞间黏附分子5 (ICAM-5)可以阻止由Aβ诱因导致的PAJU细胞凋亡,因此,我们进一步研究其在缺血缺氧环境中是否同样具有神经保护作用及其机制。研究方法1.采用稳定表达常量人ICAM-5蛋白的PAJU-TLN细胞株和具有NEO抗性且不表达ICAM-5的PAJU-NEO细胞株作为神经元缺血缺氧培养的细胞模型,先建立无血清培养PAJU细胞模型,观察ICAM-5蛋白表达对PAJU细胞的作用；然后建立缺血缺氧培养PAJU细胞模型并验证模型的有效性,进一步研究ICAM-5蛋白表达对PAJU细胞的作用。2.用缺血缺氧作为刺激源,同时分别对PAJU-TLN和IPAJU-NEO细胞进行不同时间段刺激,采用四唑盐(MTT)比色法检测细胞活力、Hoechst 33258细胞核染色观察核凋亡、流式细胞仪检测细胞凋亡,以了解ICAM-5是否在缺血缺氧环境中具有对PAJU细胞的保护作用。3.采用蛋白免疫印迹技术检测缺血缺氧对ICAM-5表达的影响,以及ICAM-5在缺血缺氧刺激后埃兹蛋白-根蛋白-膜突蛋白,磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶信号通路(ERM/PI3K/Akt)中磷酸化蛋白表达的影响,以了解促进细胞存活的信号通路是否被激活。研究结果1.表达ICAM-5蛋白的PAJU-TLN细胞在缺血作用中的存活率比较PAJU-NEO细胞高,在缺血缺氧中的凋亡率比PAJU-NEO减少,表现为细胞存活率升高和凋亡率降低,其差异具有统计学意义。2. PAJU细胞在经受较长时间缺血缺氧作用后,ICAM-5蛋白的表达逐渐降低,在无血清且2%的缺氧环境中培养至72小时即完全停止表达。3.通过免疫印记技术发现,ICAM-5蛋白的表达使Moesin蛋白的558位苏氨酸(Thr558)残基磷酸化而形成活化状态,经缺血缺氧刺激后引起其家族蛋白中的Ezrin蛋白的第567位苏氨残基酸(Thr567)和Radixin蛋白的564位苏氨酸(Thr564)出现磷酸化激活,并由此导致了PI3K蛋白调节亚单位p85a的508位酪氨酸残基(Tyr508, p85a)磷酸化,引起PI3K活化,PI3K直接促使Akt蛋白的473位丝氨酸(Ser-473)残基磷酸化而激活了信号通路。4.PI3K特异性抑制剂LY294002不仅下调PI3K蛋白表达,而且还可以下调ICAM-5、磷酸化ERM、磷酸化P13K及磷酸化Akt蛋白的表达,而总ERM、总P13K及总Akt却表达于未经LY294002和缺血缺氧处理以及经过LY294002和缺血缺氧处理过的PAJU细胞,验证了ERM/PI3K/Akt信号通路的激活。研究结论1.我们首次证明了ICAM-5蛋白表达在缺血缺氧中具有神经保护作用,可以减轻缺血缺氧所致的PAJU细胞凋亡,促进细胞存活。2.首次证明缺血缺氧对ICAM-5具有抑制表达的作用,较长时间暴露于缺血缺氧环境中可以使ICAM-5表达下调并停止表达。3.首次证明在缺血缺氧环境中ICAM-5仍然可以通过激活ERM而激活PI3K/Akt信号通路,因此在缺血缺氧中可以促进PAJU细胞存活,减少凋亡。