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目的:早产儿脑损伤(Brain injury in premature infants,BIPI)是早产儿的常见并发症之一,与后期的脑性瘫痪及潜在神经功能发育障碍有关。肠道菌群与神经系统的突触形成、递质释放、营养物质产生、血脑屏障的发育、菌群-肠-脑轴等有密切联系。本研究旨在通过高通量测序技术对早产极低出生体重儿(Very low birth weight infants,VLBWI)粪便样本16S rDNA进行测序,探讨肠道菌群对早产VLBWI脑损伤发生的影响,为BIPI的防治提供可靠依据。方法:将2018年05月30日至2019年09月30期间于生后24小时内收住苏州大学附属儿童医院新生儿重症监护病房(Neonatal intensive care unit,NICU)和/或苏州市立医院母子中心NICU、出生体重<1500g且住院时间≥28天的早产儿作为研究对象进行前瞻性研究,采集并记录所有早产儿出生时情况、入院时情况、母亲一般情况、早产儿原发基础疾病及合并症、早产儿住院期间治疗情况等临床资料,分别于生后第1、4、7、14、21、28天留取粪便标本;生后3天内完善头颅B超,如有异常之后每周复查,如无异常则每2周复查直至出院,第28天完善头颅MRI;分别于生后26～28天行新生儿行为神经测定(Neonatal behavioral neurological assessment,NBNA)。将研究对象分为BIPI组和非BIPI组:根据BIPI诊断标准,将发生BIPI的早产VLBWI作为BIPI组,未发生BIPI的VLBWI中随机抽取一般资料与BIPI组相匹配的早产VLBWI作为非BIPI组,采用16S rDNA高通量测序动态检测两组患儿粪便的肠道菌群,分析比较两组早产VLBWI生后肠道菌群定植情况及其在BIPI发生过程中的变化差异。结果:一、临床基本资料信息:研究期间共观察189例早产儿,排除入院未经抢救即死亡或积极抢救治疗数小时之内死亡22例,住院不满28天26例,外科手术8例,先天性胃壁缺如1例,中枢神经系统感染4例,染色体异常1例,其中发生BIPI的有46例为BIPI组,未发生BIPI的81早产VLBWI中,随机抽取一般资料与BIPI组相匹配的72例作为非BIPI组,两组共118例;男58例(49.2%),女(50.8%),出生体重800～1500g,平均出生体重(1247.6±199.7)g,胎龄27～32+2周,平均胎龄(30.17±1.28)周。BIPI组与非BIPI组临床资料比较显示:(1)两组早产VLBWI性别、出生体重、胎龄、分娩方式、是否自然受孕、是否双胎或多胎、是否小于胎龄儿、Imin Apgar评分、5min Apgar评分、母亲孕期一般情况、败血症、感染性肺炎、支气管肺发育不良(Bronchopulmonarydysplasia,BPD)、早产儿视网膜病(Retinopathyof prematurity,ROP)、血小板总数<100× 109/L、坏死性小肠结肠炎(Necrotizing enterocolitis,NEC)、开奶日龄、首次抗生素为非限制级、首次抗生素为限制级、首次抗生素为非限制级与限制级联用、首次抗生素为限制级与特殊级联用、脐静脉置管、PICC置管、氧疗时间、无创机械通气、无创机械通气时间比较无明显差异(P>0.05);(2)BIPI组新生儿呼吸衰竭、新生儿呼吸窘迫综合征(Neonatal respiratory distress syndrome,NRDS)、频发呼吸暂停、血红蛋白浓度<90g/L、酸中毒、肠外营养相关性胆汁淤积症(Parenteral nutrition associated cholestasis,PNAC)、动脉导管未闭(Patent ductus arteriosus,PDA)、宫外生长迟缓(Extrauterine growth restriction,EUGR)发生率明显高于非BIPI组(P<0.05);肠外营养(Parenteral nutrition,PN)时间、抗生素使用时间、PICC置管时间、输血≥3次、有创机械通气、有创机械通气时间明显多于非BIPI组(P<0.05)。Logistic多因素回归分析显示:频发呼吸暂停(OR=4.031,95%CI:1.355～11.995)、有创通气时间(OR=1.273,95%CI:1.056～1.534)、PN 时间(OR=1.035,95%CI:1.002～1.068)、EUGR(OR=5.883,95%CI:1.984～17.443)为早产VLBWI生后发生BIPI的独立危险因素。二、粪便16S rDNA高通量测序结果:(1)物种相对丰度分析显示,在门水平上,两组早产VLBWI肠道菌群均表现为厚壁菌门相对丰度一过性下降而变形菌门相对丰度一过性增高;BIPI组在第14天时变形菌门相对丰度最高而厚壁菌门相对丰度最低;非BIPI组提前至生后第7天。BIPI组生后第4天以厚壁菌门占优势,后随日龄增加而减少,变形菌门逐渐占优势,生后第14天,BIPI组厚壁菌门最低,后随日龄增加而增加,在生后第28天厚壁菌门再次占优势;而非BIPI组自生后第4天起,均以变形菌门占优势。发展为BIPI的早产VLBWI生后4～28天变形菌门相对丰度均低于非BIPI组,而厚壁菌门相对丰度均高于非BIPI组。(2)Alpha多样性分析结果:①BIPI组chao1指数、observed species指数在生后第7天一过性增大,后随日龄增加而减小;非BIPI组chao1指数、observed species指数在生后第4天最高,自第7天起下降,生后21天时最低,21～28维持在相对稳定水平。BIPI组chao1指数、observed species指数在生后第4-28天均高于非BIPI组,且在生后21、28天时差异有统计学意义(P<0.05)。②BIPI组Shannon指数、Simpson指数均在第7天有一过性上升,自第14天起随日龄增加而降低;非BIPI组Shannon指数、Simpson指数在生后第4天最高,后随日龄增长而减小,21～28基本稳定;BIPI组Shannon指数、Simpson指数在生后第7～28天均高于非BIPI,且在生后21、28天时差异有统计学意义(P<0.05)。(3)Beta多样性分析结果:在第21天、28天时BIPI组与非BIPI组间菌群差异明显,同组内部之间样本聚集。(4)菌群群落结构差异显著性分析:两组早产VLBWI在生后第4天开始即有差异菌群。与非BIPI组比较,生后第4天,BIPI组变形菌门(P=0.046)、γ-变形菌纲(P=0.035)、肠杆菌科(P=0.040)明显减少,差异有统计学意义,而厚壁菌门(P=0.025)、拟杆菌门(P=0.002)显著增加。生后第7天,BIPI组变形菌门(P=0.003)、γ-变形菌纲(P=0.002)、肠杆菌科(P=0.001)显著减少,而厚壁菌门(P=0.026)、放线菌门(P=0.046)、芽孢杆菌纲(P=0.012)显著增多。生后第14天,BIPI组肠杆菌科(P=0.002)、肠杆菌属(P=0.002)减少,差异有统计学意义,拟杆菌门(P=0.037)、拟杆菌属(P=0.036)明显增多。生后21天,BIPI组变形菌门(P=0.001)、γ-变形菌纲(P=0.001)、梭菌纲(P=0.021)、肠杆菌(P<0.001)、梭菌(P=0.002)、双歧杆菌(P=0.021)显著减少,肠球菌(P=0.003)、拟杆菌(P=0.001)明显增多,差异有统计学意义;生后第28天变形菌门(P=0.001)、梭菌纲(P=0.012)、肠杆菌(P<0.001)、梭菌(P=0.001)、双歧杆菌(P=0.010)显著减少,而拟杆菌门(P=0.001)、肠球菌属(P=0.003)、拟杆菌属(P<0.001)、肠球菌(P=0.001)、拟杆菌(P=0.001)明显增多,差异有统计学意义。结论:(1)频发呼吸暂停、有创通气时间、PN时间、EUGR为早产VLBWI生后发生BIPI的独立危险因素。(2)两组早产VLBWI肠道菌群定植模式均表现为变形菌门相对丰度一过性增高;发展为BIPI的早产VLBWI变形菌门相对丰度达峰时间晚于非BIPI组。发展为BIPI组的早产VLBWI生后4～28天变形菌门相对丰度均低于非BIPI组。(3)发展为BIPI的早产VLBWI生后4～28天物种丰度及多样性高于非BIPI组,且于第21、28天差异显著。(4)发展为BIPI的早产VLBWI于生后第4天起即有差异菌群。发展为BIPI的早产VLBWI肠道菌群中梭菌、双歧杆菌减少,而肠球菌、拟杆菌增多。