目的:　　肿瘤发病机制的复杂性不仅体现在由基因突变或缺失导致的遗传改变，还表现在以DNA甲基化和组蛋白修饰为代表的表遗传学改变。如果表遗传修饰发生改变，将对基因的表达、染色体的浓集、分离、细胞的凋亡等造成重大影响。肿瘤抑制基因启动子区甲基化能抑制转录起始，导致基因沉默，在肿瘤的发生和发展中扮演着极其重要的角色。组蛋白修饰可使染色体结构发生改变，细胞中催化组蛋白修饰的酶可将其所携带的信息传递给染色体调节因子，最终导致基因表达的改变。　　MGMT是一种高效的DNA修复酶，对保护细胞免受烷化剂损害，防止细胞癌变和死亡具有极为重要的作用。如果MGMT异常，不能发挥正常的作用或作用不足，将导致喉癌细胞DNA中G∶C配对转换为A∶T配对，就会导致癌基因的激活和抑癌基因失活，进一步发展引起肿瘤。RASSF1A是RAS相关区域家族1A基因，定位于染色体3p21.3，是Dammann等于2000年克隆到的新基因。Huebner认为RASSF1A基因可能是第一个重要的主要由启动子甲基化而失活的抑癌基因。目前认为，RASSF1A可能参与抑制Ras/RASSF1/ERK通路的信号传导，阻断Ras生长效应信号由细胞外传向细胞内，使其丧失介导细胞分化、促进细胞增殖和激活原癌基因的功能，从而发挥抑制肿瘤的作用。　　喉癌是常见的头颈部恶性肿瘤，我国东北地区是其高发区。尽管近30年来喉功能保留率已经有了很大的提高，但总的5年生存率没有大的变化。因此，只有不断完善喉癌发病机制的研究并由此开展新的治疗方法，才能有效提高喉癌疗效和预后。　　材料与方法:　　一、实验对象　　人喉癌Hep-2细胞系。选择2008年1月-2009年5月中国医科大学附属盛京医院耳鼻喉科住院的喉鳞状细胞癌患者（喉癌组）50例，男44例，女6例，年龄40-74岁，平均58±9.76岁。取全喉切除标本距肿瘤2.0cm以上正常喉黏膜组织15例作为对照组。手术取下的新鲜标本立即浸入液氮中后置于-70℃冰箱保存。喉癌组按2002年UICC喉癌分期标准:其中早期（Ⅰ期+Ⅱ期）24例(T1N08例，T2N016例)，声门上型13例，声门型11例。中晚期（Ⅲ期+Ⅳ期）26例(T3N08例，T4N07例，T3N14例，T4N13例，T3N23例，T3N31例)，声门上型14例，声门型12例。所有喉癌组织均经病理证实为鳞癌。术前均未经放化疗治疗。标本提取均经中国医科大学附属盛京医院伦理委员会批准，并签署患者知情同意书。　　二、实验方法　　1、细胞培养　　Hep-2细胞按常规培养于含10％胎牛血清RPMI-1640的培养液，NaHC02浓度2g/L，青霉素G浓度100U/L，链霉素浓度100μg/L，37℃含5％CO2的湿润空气的恒温密闭式培养箱培养。　　2、实验分组　　(1)对照组　　同期培养不加药的喉癌Hep-2细胞。　　(2)实验组　　①5-Aza-dC组:5μmol/L5-Aza-dC培养72小时;　　②TSA组:加TSA300nmol/L培养24小时;　　③5-Aza-dC联合TSA组:加5μmol/L5-Aza-dC48小时后加TSA300nmol/L继续培养24小时。　　3、引物设计　　MSP、实时荧光定量PCR、CHIP引物序列和反应条件见表1-3，引物由TaKaRa公司合成。　　4、甲基化特异性PCR法检测DNA甲基化水平　　分别提取喉癌细胞系，喉癌组织中DNA。紫外分光光度仪定性、定量。亚硫酸氢钠修饰DNA，Wizard DNA Clean-up Systerm(Promega)纯化。离心沉淀DNA。采用甲基化特异性PCR方法。PCR反应条件:95℃12 min后，95℃变性30s，各种基因不同退火温度退火45s，72℃延伸30s，35个循环，72℃再延伸7min，琼脂糖凝胶电泳，EB染色。结果经Alpha Image2000自动成像仪成像采集数据，分析电泳结果。实验重复三次，取其平均值进行统计分析。　　5、SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测肿瘤抑制基因mRNA表达　　用TRlzol试剂一步法分别提取喉癌细胞系，喉癌组织总RNA(按说明书进行)。按照反转录试剂盒说明将其反转录成cDNA第一链。无RNA酶的双蒸水将cDNA10倍稀释。进行荧光定量PCR扩增，由PCR反应曲线得到Ct值，以GAPDH为内参，采用2-△△ct方法进行相对定量。实验重复三次，取其平均值进行统计分析。　　6、染色质免疫沉淀分析检测甲基化H3-K9、乙酰化H3-K9、甲基化H3-K4水平　　收集细胞或组织剪碎，甲醛交联组蛋白和DNA。酶切后分别加H3-K9，H3-K4甲基化和H3-K9乙酰化抗体，免疫血清或Tris-EDTA缓冲液。收集抗体/蛋白复合物，沉淀下来的染色质通过PCR扩增检测结果。结果经Alpha Image2000自动成像仪成像采集数据，分析电泳结果。　　三、统计学处理　　应用SPSS17.0软件分析，mRNA表达水平定量测定结果用t检验，甲基化和临床病理参数的关系采用x2检验（Fisher，精确概率法），组间相关分析用Spearman等级相关。P＜0.05，认为差异具有统计学意义。　　实验结果:　　1、喉癌组织基因MGMT的甲基化率为54％，RASSF1A的甲基化率为62％，正常对照组无DNA甲基化。两种基因在喉癌组织中甲基化情况与年龄，性别，分化程度，临床T分级，病理类型和有无淋巴结转移均无相关性(P＞0.05)。　　2、喉癌组两种基因mRNA表达明显低于正常对照组(P＜0.05)。基因mRNA表达在甲基化组明显低于非甲基化组(P＜0.05)。　　3、MGMT、RASSF1A基因启动子区域组蛋白H3-K9甲基化状态与DNA甲基化状态正相关(P＜0.05)，即DNA甲基化者，H3-K9甲基化程度也高;无甲基化者，H3-K9甲基化程度很低。　　4、MGMT、RASSF1A基因启动子区域组蛋白H3-K4甲基化状态与DNA甲基化负相关(P＜0.05)，即DNA甲基化者，H3-K4甲基化程度低;无甲基化者，H3-K4甲基化程度高。　　5、MGMT、RASSF1A基因启动子区域组蛋白H3-K9乙酰化与DNA甲基化无相关性（P＞0.05）。　　6、TSA对MGMT基因启动子区域组蛋白H3-K9甲基化无影响，但能轻度降低RASSF1A基因启动子区域组蛋白H3-K9甲基化水平。5-Aza-dC明显降低两种基因启动子区域H3-K9甲基化程度，联合给予5-Aza-dC和TSA对MGMT基因来说与单独给予5-Aza-dC的作用相似，但联合给予5-Aza-dC和TSA对RASSF1A基因来说起协同增效作用。　　7、5-Aza-dC对两种基因启动子区域组蛋白H3-K4甲基化的作用与对启动子区域H3-K9甲基化的作用恰好相反，5-Aza-dC明显提高沉默位点H3-K4甲基化程度，TSA对启动子区域H3-K4甲基化轻度提高，联合给予5-Aza-dC和TSA有协同增效作用。　　8、5-Aza-dC对MGMT基因启动子区域组蛋白H3-K9乙酰化无作用，TSA明显提高沉默位点H3-K9乙酰化程度，联合给予5-Aza-dC和TSA对MGMT基因来说与单独给予TSA的作用相似。5-Aza-dC对RASSF1A基因启动子区域组蛋白H3-K9乙酰化有增强作用，TSA明显提高沉默位点H3-K9乙酰化程度，联合给予5-Aza-dC和TSA有协同增效作用。　　9、5-Aza-dC能降低DNA甲基化，TSA不影响两种基因DNA甲基化。　　10、5-Aza-dC可使基因表达增强，TSA使基因表达轻度增强，5-Aza-dC及TSA可协同促进基因表达。　　结论:　　1、在人喉癌Hep-2细胞系及喉癌组织中，MGMT、RASSF1A肿瘤相关基因启动子区CpG岛的甲基化与基因表达降低相关，甲基化抑制剂可使甲基化的MGMT、RASSF1A发生去甲基化，并使基因表达增强。　　2、在喉癌组织中，MGMT、RASSF1A基因启动子区组蛋白H3-K9甲基化与DNA甲基化正相关，而组蛋白H3-K4甲基化与DNA的甲基化负相关。H3-K9乙酰化与DNA甲基化无相关性。基因启动子区组蛋白H3-K9甲基化与DNA的甲基化在基因的沉默机制中具有协同作用，而组蛋白H3-K4甲基化拮抗DNA甲基化所产生的基因沉默。　　3、在喉癌细胞系中，甲基化抑制剂可影响MGMT、RASSF1A基因启动予区组蛋白H3-K9甲基化、H3-K4甲基化，而且与DNA甲基化状态相关，乙酰化制剂可影响MGMT基因的H3-K4甲基化和H3-K9乙酰化，影响RASSF1A基因的H3-K9甲基化、H3-K4甲基化和H3-K9乙酰化，但与DNA甲基化状态无关。