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目的:采用TGF-β1活化肝星状细胞,探讨肝苏颗粒主要有效物质对其抑制作用和作用机制,从而初步揭示肝苏颗粒抗肝纤维化的可能机理,为其进一步开发和应用提供依据。方法:1.文献研究查阅近年来肝苏颗粒及赶黄草有关文献报道,包括肝苏颗粒来源、临床应用、实验研究报道等进行文献数据分析。2.实验研究建立TGF-β1诱导的人肝星状细胞LX-2活化模型,MTT法筛选肝苏颗粒主要有效物质赶黄草总黄酮的作用剂量,设定高、中、低三个剂量,采用酶联免疫吸附法检测不同剂量下细胞培养液中I型胶原(Col I)和纤连蛋白(FN)的含量,划痕实验检测细胞迁移率,胶原收缩实验检测胶原收缩情况,流式细胞技术检测细胞凋亡率,RT-PCR法检测TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白m RNA的表达,western Blot法检测凋亡相关蛋白及TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白的表达情况;并观察在给予TGF-β1/Smads信号通路抑制剂LY2109761后,赶黄草总黄酮对活化LX-2细胞胶原收缩和TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白表达的影响。结果:1.肝苏颗粒的文献研究结果通过对关于肝苏颗粒的文献进行梳理、研究后发现,肝苏颗粒为现在常用的治疗肝病的中药制剂之一,主要功效为降酶、保肝、退黄,其化学成分主要为黄酮类和酚酸类化合物。实验研究和临床应用文献均表明,肝苏颗粒对肝纤维化具有治疗作用;药学和药理研究可证明,赶黄草总黄酮是当前公认的赶黄草保肝、抗脂肪肝的主要药效物质,也是其治疗肝纤维化的重要有效物质。2.LX-2活化模型的建立和赶黄草总黄酮药效浓度确定TGF-β1浓度为2、4、6、8、10、12、14、16μg/L均可促进LX-2细胞增殖(P<0.01),6μg/L时的增殖活性和细胞培养液中α-SMA含量最高,当低于或超过该剂量时作用均减弱,提示6μg/L的TGF-β1是活化LX-2的最佳浓度,故以之为LX-2细胞活化浓度。赶黄草总黄酮药物浓度的筛选结果显示,赶黄草总黄酮浓,度为13mg/L时,细胞存活率大于80%,而浓度大于17mg/L时,药物呈现出明显的细胞毒性,因此选用5、9、13mg/L三个剂量进行后续实验。3.赶黄草总黄酮对活化的LX-2一般状态和细胞凋亡的影响MTT法结果显示,赶黄草总黄酮可抑制TGF-β1活化后的LX-2细胞的增殖,且药物浓度越高抑制作用越明显,在13mg/时有显著抑制作用(P<0.01)。划痕实验显示赶黄草总黄酮可抑制TGF-β1活化后的LX-2细胞的迁移,在9mg/L时抑制作用显著(P<0.01);胶原收缩实验显示,TGF-β1组胶原收缩明显增加,而赶黄草总黄酮作用后的各组与单纯TGF-β1组相比较,胶原的收缩程度降低,作用效果呈剂量依赖。细胞液基质检测显示,赶黄草总黄酮可明显抑制活化后LX-2细胞液中FN和ColⅠ的升高(P<0.01);流式细胞仪检测显示TGF-β1对细胞凋亡无明显影响,而赶黄草总黄酮可促进活化后的LX-2细胞凋亡,作用效果呈剂量依赖,在赶黄草总黄酮作用浓度达到9mg/L时有统计学意义(P<0.01);western blot结果显示,TGF-β1活化的LX-2细胞中Bcl-2表达增加而Bax表达降低,但与未活化组比较无显著性差异;赶黄草总黄酮各组作用的LX-2细胞Bcl-2的表达显著降低而Bax的表达则明显增加(P<0.05)。4.赶黄草总黄酮对活化肝星状细胞TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白的影响RT-PCR实验显示,赶黄草总黄酮可显著抑制LX-2细胞中α-SMA m RNA的表达(P<0.01)。另外,赶黄草总黄酮作用后,TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白Smad2、Smad3 m RNA表达均显著减少(P<0.01);而Smad7的表达稍有增加,在药物浓度达到13mg/L时,差别具有统计学意义(P<0.05)。同样,western blot结果显示,赶黄草总黄酮作用后,Smad3、p-Smad2和p-Smad3的表达均不同程度减少,而Smad7的表达稍增加,且在9mg/L时具有统计学意义(P<0.01)。5.赶黄草总黄酮对活化肝星状细胞TGF-β1/Smads信号通路抑制后的影响采用特异性TGF-β1/Smads信号通路抑制剂LY2109761作用于LX-2后,胶原收缩结果显示,单纯用赶黄草总黄酮和单纯用LY2109761均可抑制胶原收缩(P<0.05),而在使用LY2109761预处理后再给予赶黄草总黄酮,抑制效果大于单纯给药(P<0.01);western blot实验结果显示,单纯使用赶黄草总黄酮和LY2109761均可抑制α-SMA、p-Smad2和p-Smad3的表达(P<0.05),而LY2109761预处理后再给予赶黄草总黄酮,抑制效果大于单纯给药(P<0.01)。结论:1.肝苏颗粒具有抗肝纤维化作用,赶黄草总黄酮是其重要的有效物质。2.赶黄草总黄酮对TGF-β1活化的肝星状细胞LX-2具有抑制作用,可抑制增殖和降低基质分泌,机制与诱导凋亡和抑制TGF-β1/Smads信号通路有关。