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目的1.探讨食管鳞癌中PI3K/AKT/m TOR信号通路对LSD1的调控作用。2.探讨食管鳞癌中LSD1对mTOR信号通路的调控作用。方法1.用PI3K/AKT/m TOR信号通路抑制剂(LY294002、RAD001和PP242)作用于食管鳞癌细胞ECa109,CCK-8法检测三种药物对食管鳞癌细胞增殖的影响。2.分别用LY294002、RAD001和PP242处理食管鳞癌细胞ECa109,Western blot检测PI3K/AKT/m TOR信号通路相关蛋白Raptor、Rictor、p-AKT(Ser473)、p-p70S6K及LSD1和组蛋白H3K4me2的表达情况。3.CCK-8法检测PI3K抑制剂LY294002分别与不同浓度RAD001和PP242联合应用对食管鳞癌细胞增殖的影响,并计算联用指数CI以判定联用效果。4.嘌呤霉素筛选出稳定转染Rictor-sh RNA的ECa109细胞,CCK-8法检测转染Rictor-sh RNA后PI3K/AKT/m TOR信号通路抑制剂(LY294002、RAD001和PP242)对ECa109细胞增殖影响的变化。5.Western blot检测转染Rictor-shRNA后ECa109细胞中Rictor、LSD1的表达变化。6.分别用LSD1-sh RNA/LSD1-si RNA及新合成的LSD1抑制剂244和TCP(LSD1抑制剂阳性对照药)处理ECa109细胞,Western blot检测LSD1、Raptor、Rictor和p-p70S6K蛋白的表达变化。结果1.CCK-8结果显示,食管鳞癌细胞分别用LY294002、RAD001和PP242处理后,细胞增殖明显变慢,且具有浓度依耐性。2.Western blots结果显示,LY294002处理后,细胞中p-p70S6K的表达下降,Rictor、Raptor、p-AKT(Ser473)表达增加,组蛋白H3K4me2的表达呈现剂量和时间依赖性增加,但LSD1的表达无明显变化;RAD001处理后,Rictor、Raptor、p-p70S6K表达降低,p-AKT(Ser473)表达上调,LSD1的表达量降低,H3K4me2的表达量增加,且LSD1和H3K4me2的表达显示出剂量和时间依赖性;而PP242处理后,Rictor表达降低,Raptor、p-AKT(Ser473)、p-p70S6K表达增加,H3K4me2及LSD1的表达都无显著变化。3.CCK-8结果显示,LY294002分别与RAD001和PP242联用后,联合用药组的增殖抑制作用强于单独用药处理组。且经计算,LY294002和RAD001的联用指数CI值都小于1,提示二者联用为协同作用;LY294002和PP242的联用指数CI在低浓度时小于1,在最大浓度联用时大于1,提示二者联用在低浓度时具有协同作用,而高浓度时则产生拮抗作用。4.CCK-8结果显示,加入不同浓度的LY294002,RAD001,PP242后,与未转染组及Control-sh RNA组相比,转染Rictor-sh RNA组的细胞增殖被抑制的更明显。5.Western blot结果显示,与未转染组比较,转染Rictor-sh RNA后,食管鳞癌细胞ECa109中Rictor的表达明显降低,LSD1的表达明显增加。6.LSD1-siRNA/LSD1-shRNA、LSD1抑制剂TCP和244均能使Rictor的表达量明显降低,而使Raptor和p-p70S6K的表达增加,RNA干扰LSD1的表达和LSD1抑制剂TCP能明显下调ECa109细胞中LSD1的蛋白表达。结论1.PI3K/AKT/m TOR信号通路抑制剂(LY294002、RAD001、PP242)均能够抑制食管鳞癌细胞的增殖。用sh RNA下调食管鳞癌细胞中Rictor表达能够增强食管鳞癌细胞对这三种抑制剂的敏感性。2.食管鳞癌中PI3K/AKT/mTOR信号通路与LSD1之间存在相互调控作用,抑制m TOR不仅能调节LSD1的表达,还能抑制其去甲基化功能;当LSD1被抑制后能调节m TORC1/C2的关键组分Raptor和Rictor及靶基因p-p70S6K的表达。