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多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome,PCOS）主要特点是稀发排卵或无排卵、高雄激素血症及超声下卵巢呈多囊样改变。作为育龄妇女最常见的内分泌紊乱性疾病之一（发病率高达5%11%）,该疾病已严重影响到女性的生殖与健康,其发病机制现被认为与胰岛素抵抗、高胰岛素血症、高雄激素血症、免疫因子失衡、环境及心理因素改变等有关,但尚不明确。在卵泡发育成熟过程中,由于卵丘颗粒细胞起了重要作用,因此颗粒细胞在多囊卵巢综合征患者卵泡发育和成熟障碍过程中扮演了重要角色。而多囊卵巢综合征因卵泡发育障碍导致无排卵,是多囊卵巢综合征患者不孕的重要原因之一。目前发现miRNAs参与生殖调控的研究大多集中于卵巢癌细胞中,有关miRNAs参与卵巢细胞增殖、凋亡和激素分泌调控的报道非常有限。研究发现,多囊卵巢综合征患者血清中miR-133b表达下降,而本课题组此前研究也发现,miR-133b与卵泡发育密切相关。在此前期研究基础上,本课题进一步研究了miR-133b对多囊卵巢综合征患者卵巢颗粒细胞增殖的影响,探讨miR-133b对多囊卵巢综合征发生发展的影响及作用机制,为干预多囊卵巢综合征提供新的靶点与思路。第一部分 miR-133b对人卵丘颗粒细胞增殖和凋亡的影响一、研究目的研究miR-133b对人卵丘颗粒细胞增殖、凋亡的影响,探索miR-133b对人卵丘颗粒细胞增殖、凋亡的作用机制。二、研究方法收集输卵管性不孕或男性因素导致不孕的女性患者的卵丘颗粒细胞,分为5组进行培养,分别为空白对照组及转染miR-133b类似物组、miR-133b类似物阴性对照组、miR-133b抑制剂组、miR-133b抑制剂阴性对照组,采用细胞增殖检测试剂盒检测人卵丘颗粒细胞增殖情况,分析miR-133b对人卵丘颗粒细胞增殖的影响;实时荧光定量PCR法检测各组细胞TAGLN2、caspase-3 mRNA表达水平,免疫印迹法检测各组细胞TAGLN2、caspase-3前体及caspase-3剪切体蛋白表达水平;流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况和细胞周期变化。三、实验结果1.人卵丘颗粒细胞培养第2天至第3天过程中,细胞增殖迅速,增殖幅度最高,随后增殖缓慢。从第4天开始,细胞开始退化死亡,至第8天,细胞完全退化死亡。在体外培养人卵丘颗粒细胞的第2天至第4天,与第2天相比,miR-133b的表达量升高（P<0.01）,caspase-3和TAGLN2的表达量降低（P<0.01）;人卵丘颗粒细胞体外培养第4天至第8天,与第4天相比,miR-133b的表达量降低（P<0.01）,而TAGLN2（P<0.01）和caspase-3（P<0.05）的表达量升高。2.CCK-8结果显示,与相应的阴性对照组相比,miR-133b mimic组人卵丘颗粒细胞增殖水平极显著性升高（P<0.01）。3.qRT-PCR和免疫印迹结果显示,与相应的阴性对照组相比,miR-133b mimic能显著下调人卵丘颗粒细胞TAGLN2（P<0.05）和cleaved caspase-3（P<0.01）的mRNA和蛋白表达水平;miR-133b inhibitor显著上调人卵丘颗粒细胞TAGLN2（P<0.05）和cleaved caspase-3（P<0.05）的mRNA和蛋白表达水平。4.流式细胞术结果显示,与相应的阴性对照组相比,miR-133b mimic组的颗粒细胞凋亡率显著性降低（P<0.01）;miR-133b mimic组G0/G1期细胞进入S和G2期的数量明显增多（P<0.01）。第二部分 miR-133b对多囊卵巢综合征患者颗粒细胞增殖的影响一、研究目的研究miR-133b对多囊卵巢综合征患者颗粒细胞增殖的影响,探讨miR-133b在多囊卵巢综合征发病机制中的作用。二、研究方法收集男性因素不孕和PCOS不孕症患者的卵泡液,分离提取其中的颗粒细胞,行体外培养后,进行如下研究:CCK-8法检测人卵丘颗粒细胞体外培养过程中的增殖情况;实时荧光定量PCR法检测颗粒细胞miR-133b、caspase-3 mRNA表达;免疫印迹检测miR-133b对人卵巢颗粒细胞株cleaved caspase-3表达的影响以及检测miR-133b对人颗粒细胞系TAGLN2表达的影响。三、研究结果1、卵丘颗粒细胞体外培养至第72小时细胞增殖达最高峰,直至培养第192小时细胞彻底凋亡（P<0.05）;2、荧光定量PCR法、免疫印迹法显示,多囊卵巢综合征患者、男性因素不孕的患者的miR-133b与caspase-3表达,呈相反趋势;miR-133b类似物下调人卵巢颗粒细胞株cleaved caspase-3的表达;miR-133b抑制剂上调人卵巢颗粒细胞株cleaved caspase-3的表达;miR-133b类似物显著下调人卵巢颗粒细胞株TAGLN2的表达,而miR-133b抑制剂则上调TAGLN2的表达。第三部分 miR-133b对于多囊卵巢综合征大鼠妊娠率的影响一、研究目的研究miR-133b对多囊卵巢综合征大鼠生育能力的影响,从而探讨miR-133b在多囊卵巢综合征发病中的相关机制。二、研究方法我们采用来曲唑构建多囊卵巢综合征大鼠动物模型。用miR-133b激动剂和miR-133b拮抗剂,分别对多囊卵巢综合征大鼠进行卵巢注射,观察在多囊卵巢综合征疾病状态下,干预前后外周血激素水平与卵巢组织的病理改变、靶基因TAGLN2表达水平;将正常对照组、多囊卵巢综合征大鼠模型组、PCOS大鼠组（miR-133b激动剂处理）、PCOS大鼠组（miR-133b拮抗剂处理）的雌性大鼠与雄鼠合笼后,记录每组大鼠的妊娠情况并且计算妊娠率。三、研究结果1、光学显微镜下观察可见多囊卵巢综合征模型组大鼠卵巢卵泡多呈囊性扩张,颗粒细胞层数减少以及卵巢正常结构破坏。miR-133b激动剂组大鼠卵巢内,可见不同发育时期的卵泡及黄体,多数卵泡为初级卵泡,颗粒细胞层排列整齐,卵巢结构趋于正常。miR-133b拮抗剂组大鼠卵巢内,卵泡多呈囊性扩张,颗粒细胞层数减少;2、与其他三组相比,多囊卵巢综合征模型组大鼠血清雄激素水平明显升高,差异具有统计学意义（P<0.01）;与模型组相比,miR-133b激动剂组大鼠血清雄激素水平降低;与对照组相比,多囊卵巢综合征组大鼠血清黄体生成素水平、黄体生成素/卵泡刺激素水平显著升高;与模型组相比,miR-133b激动剂组黄体生成素水平、黄体生成素/卵泡刺激素水平降低;3、多囊卵巢综合征模型组大鼠中,TAGLN2水平表达增加;miR-133b激动剂注射组中,TAGLN2的表达水平降低;miR-133b拮抗剂注射组中,TAGLN2的表达水平恢复至对照组水平;4、四组大鼠妊娠率分别为:100%（对照组）、33.33%（PCOS组）、66.67%（miR-133b激动剂处理PCOS大鼠组）、33.33%（miR-133b拮抗剂处理的PCOS大鼠组）。全文结论1.miR-133b调节卵丘颗粒细胞中TAGLN2及caspase-3的表达水平,促进人卵丘颗粒细胞增殖;2.miR-133b可改善PCOS症状和提高妊娠率,其机制可能与靶向TAGLN2有关。