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研究背景:弥漫大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)是一种最常见的非霍奇金淋巴瘤。弥漫大B细胞淋巴瘤进展迅速,传统的化疗效果欠佳。自从抗CD20单克隆抗体(利妥昔单抗)应用于临床,利妥昔单抗联合化疗的R-CHOP方案(利妥昔单抗,环磷酰胺,阿霉素,长春新碱,泼尼松)使DLBCL的五年生存期由单纯化疗的32%提高至68%。但是,仍然有部分患者R-CHOP治疗失败,而使病情进入复发/难治阶段。患者再次使用抗CD20单克隆抗体很难得到满意效果。利妥昔单抗对DLBCL的治疗效果取决于肿瘤细胞CD20表达水平,而DLBCL的CD20表达存在异质性,CD20低表达患者对利妥昔单抗不敏感,具有先天耐药性;另外,对利妥昔单抗敏感的CD20高表达患者,经过治疗CD20表达下降甚至呈现阴性,而导致获得性耐药。不容置疑,DLBCL治疗失败的重要原因是肿瘤细胞对利妥昔单抗产生耐药,而CD20在此扮演重要角色。我们的研究发现PINK1在DLBCL细胞中具有调控CD20表达的功能。PTEN诱导激酶(PTEN-induced putative kinase 1,PINK1)基因是帕金森病的关键基因,同时PINK1与肿瘤的发生发展也密切相关。在肿瘤细胞中,PINK1通过蛋白质的泛素化调节蛋白表达而影响肿瘤细胞的生物学功能。PINK1在不同的肿瘤类型中表达存在明显的的差异,而PINK1在造血系统肿瘤中明显上调,但是PINK1在DLBCL中的作用研究很少,尤其是PINK1调节CD20表达的机制方面的研究还是空白。虽然人们很早就知道导致R-CHOP治疗失败的重要原因是DLBCL细胞对利妥昔单抗产生耐药。了解利妥昔单抗耐药的发生机制和逆转利妥昔单抗耐药的方法提高复发/难治DLBCL疗效是临床急需解决的课题。研究目的:本研究主要探究PINK1基因的表达是否与接受R-CHOP或CHOP治疗的DLBCL患者的临床预后存在相关性,PINK1基因在DLBCL中调控CD20基因表达的机制以及深入探索中国自主研发的新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor,HDACi)西达本胺和抗CD20单克隆抗体利妥昔单抗是否在DLBCL中有协同作用及其相关机制。研究方法:1,收集基因表达汇编(gene expression omnibus,GEO)数据库的DLBCL患者临床资料和基因表达数据并分析PINK1基因以及其它帕金森病相关基因的信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,mRNA)表达是否与DLBCL患者总生存率之间存在相关性;对比肿瘤组织和正常组织PINK1基因的mRNA表达差异;利用Kaplan-Meier分析PINK1的mRNA表达和R-CHOP方案或CHOP方案治疗的DLBCL病人的总生存率是否存在相关性;通过蛋白质印迹法(Western Blot)实验和四甲基偶氮唑盐法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)实验探究PINK1蛋白表达和利妥昔单抗耐药的相关性;通过相关性分析PINK1和CD20的mRNA表达在DLBCL患者肿瘤组织中是否具有相关性。2,通过短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒感染PINK1高表达DLBCL细胞系,构建稳定PINK1低表达的DLBCL细胞系,通过RT-PCR,Western Blot实验和流式细胞术验证PINK1基因是否对CD20的表达有调控作用;分别通过细胞实验和动物实验验证PINK1是否调控利妥昔单抗对DLBCL的疗效;通过免疫荧光和免疫组化技术探究PINK1的细胞定位和表达以及PINK1是否对组蛋白去乙酰化酶3(Histone deacetylase 3,HDAC3)磷酸化有调控作用;通过流式细胞术和MTT探究HDAC3抑制剂对DLBCL细胞的CD20表达是否有调控作用以及是否增加利妥昔单抗的敏感性。3,分别通过流式细胞术,Western Blot实验,RT-PCR和免疫荧光技术探究利妥昔单抗对DLBCL细胞CD20表达的是否有抑制作用;通过高通量转录组分析(RNA Sequencing,RNA seq)技术探究西达本胺对DLBCL细胞的mRNA以及相关信号通路的调控情况;通过Western Blot实验和RT-PCR验证西达本胺是否对DLBCL细胞CD20表达有调控作用以及能否逆转利妥昔单抗对DLBCL细胞CD20表达的抑制作用;分别通过MTT实验和小鼠移植瘤模型验证西达本胺和利妥昔单抗是否在DLBCL中具有协同抗肿瘤作用;分别通过MTT实验和流式细胞术探究西达本胺单药是否对DLBCL细胞的增殖和细胞周期的有调控作用。研究结果:1,数据分析发现在R-CHOP治疗的DLBCL患者中,PINK1基因的表达可以作为不良预后的指标;发现PINK1高表达的病人使用R-CHOP方案和CHOP方案具有相同临床预后;发现PINK1在DLBCL细胞的表达与利妥昔单抗耐药明显相关;证明PINK1和CD20的mRNA表达呈明显的负相关。2,构建稳定PINK1低表达的细胞,通过RT-PCR,Western Blot实验和流式细胞术证明PINK1基因对CD20的mRNA和蛋白质表达有负性调控作用;细胞实验和动物实验证明降表达PINK1有助于增敏利妥昔单抗对DLBCL的作用;通过免疫荧光和免疫组化技术证明PINK1的细胞定位是细胞核和细胞质,PINK1能磷酸化细胞核HDAC3的S424位点而不影响HDAC3的表达;流式细胞术和MTT实验证明HDAC3抑制剂能促进DLBCL细胞的CD20表达并调节DLBCL细胞对利妥昔单抗的敏感性。3,通过流式细胞术,Western Blot实验,RT-PCR和免疫荧光技术证明利妥昔单抗能下调DLBCL细胞的CD20表达;通过RNA seq技术发现西达本胺对DLBCL细胞的mRNA表达有明显调控作用,而通过差异基因富集分析发现,西达本胺主要调控细胞膜蛋白的mRNA表达,并对造血信号通路的mRNA表达有明显的调控作用,其中包括CD20的mRNA表达。通过Western Blot实验和RT-PCR技术证明西达本胺通过促进CD20转录表达进而逆转利妥昔单抗对CD20的下调作用;分别通过体内和体外实验证明西达本胺和利妥昔单抗在DLBCL中有协同抗肿瘤作用;分别通过MTT实验和流式细胞术证明西达本胺单药通过调控细胞周期G2-M阻滞抑制DLBCL细胞的增殖。研究结论:1,PINK1在DLBCL中的表达和利妥昔单抗耐药相关2,PINK1通过磷酸化细胞核HDAC3调控DLBCL的CD20表达3,新型HDAC抑制剂西达本胺通过上调DLBCL的CD20表达增敏利妥昔单抗的疗效