论文部分内容阅读
第一部分 CircPIK3R1抑制非小细胞肺癌的转移目 的肺癌转移是导致肺癌预后较差的主要原因,因此研究肺癌转移的相关分子机制对提高肺癌患者的预后非常重要。非小细胞肺癌占肺癌的大多数,目前环状RNA circPIK3R1在调控非小细胞肺癌转移的研究尚无报道。本项目首先检测circPIK3R1在NSCLC组织和细胞株中的相对表达量,然后探讨circPIK3R1对非小细胞肺癌转移的影响,并阐述其具体作用机制。方 法（1）用qRT-PCR检测circPIK3R1在NSCLC组织和细胞株中的相对表达量;（2）分析circPIK3R1的结构,分别设计circPIK3R 1的对向和反向引物进行RT-PCR后做琼脂糖凝胶电泳;将circPIK3R1反向引物的产物切胶回收后进行Sanger测序;用 RNase R 酶处理总 RNA,qRT-PCR 检测 circPIK3R1 和 PIK3R1 mRNA 的表达量;用鹅膏蕈碱（α-amanitin,AMA）处理A549细胞后分别在不同时间点qRT-PCR检测circPIK3R1和PIK3R1 mRNA的表达量;A549和H460细胞分别提取细胞核和细胞质,qRT-PCR检测circPIK3R1在细胞核和细胞质中的含量;FISH实验检测circPIK3R1在细胞中的定位;（3）在A549和H460细胞中分别过表达circPIK3R1,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭;（4）用RIP实验富集circPIK3R1,检测与circPIK3R1结合miRNAs,双荧光素酶报告实验检测miRNA与circPIK3R1结合的可能性,Western Blot检测相关通路蛋白的表达变化;（5）设计针对circPIK3R1的siRNAs,在A549和H460细胞中分别敲低circPIK3R1,检测相关通路蛋白的表达变化;在A549和H460细胞中过表达miR-301a或同时过表达circPIK3R1,Western Blot和Transwell实验检测circPIK3R1能否抑制miR-301a的促癌功能;（6）在A549细胞中过表达circPIK3R1后,裸鼠尾静脉注射细胞,6周后取出肺组织,计数肿瘤转移结节,病理切片并H＆E染色,镜下观察并计数肺部肿瘤转移结节。结 果（1）qRT-PCR实验结果显示circPIK3R1在NSCLC组织和细胞株中均低表达;（2）circPIK3R1由PIK3R1 mRNA的第一个外显子和部分5’-UTR组成,只有在cDNA中可以扩增出circPIK3R1目的条带,而基因组DNA（gDNA）中由于PIK3R1引物跨外显子也无条带扩增出;Sanger测序结果显示有预测的circPIK3R1反向拼接位点的存在;用RNase R酶处理总RNA后,circPIK3R1的含量减少不明显,而线性PIK3R1 mRNA的含量明显减少,说明circPIK3R1耐受RNA酶的降解。AMA处理细胞后显示circRNA半衰期明显比线性RNA长;核质分离qRT-PCR和FISH实验结果显示circPIK3R1在NSCLC细胞中主要定位于细胞质;（3）过表达circPIK3R1明显抑制NSCLC细胞的迁移和侵袭能力;（4）RIP实验显示circPIK3R1可以结合miR-301a;荧光素酶双基因报告系统结果显示miR-301 a可以与circPIK3R1预测的序列位点结合;Western Blot结果显示circPIK3R1通过miR-301a/PTEN轴抑制EMT相关蛋白。敲低circPIK3R1明显抑制PTEN蛋白并促进NSCLC细胞的EMT相关蛋白;miR-301a通过PTEN/AKT通路促进NSCLC的EMT,而circPIK3R1可以抑制miR-301a的促癌作用;（5）体内实验结果显示,过表达circPIK3R1组裸鼠的肺部肿瘤转移灶数目明显少于对照组。小 结环状RNA circPIK3R1主要存在于NSCLC细胞的细胞质中,在NSCLC组织和细胞株中均低表达,而过表达circPIK3R1可以抑制NSCLC细胞的迁移和侵袭能力,进一步研究发现,circPIK3R1可以通过miR-301a/PTEN轴抑制EMT相关蛋白的表达,从而发挥抑制NSCLC转移的作用。第二部分 外泌体circPIK3R1通过抑制M2型巨噬细胞极化进而抑制NSCLC细胞转移目 的肿瘤微环境（Tumor Microenvironment,TME）在NSCLC的进展中发挥重要的作用,肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophages,TAMs）作为TME的重要组成部分,通过多种机制促进肿瘤转移。本项目将进一步探究circPIK3R1能否通过肿瘤微环境参与调控NSCLC转移及可能的作用机制,揭示circPIK3R1在TME中的作用。方 法（1）用Rnase A处理细胞,或同时加入Triton X-100处理细胞,qRT-PCR检测细胞培养基中circPIK3R1的含量;提取外泌体,电镜观察外泌体,粒径分析仪分析外泌体的大小,Western Blot检测到了外泌体的相关标志物;在NSCLC细胞中过表达circPIK3R1后检测外泌体中circPIK3R1的含量;（2）用外泌体miR-301a或同时用外泌体circPIK3R1处理巨噬细胞,qRT-PCR检测巨噬细胞中circPIK3R1的含量;荧光示踪实验观察巨噬细胞摄取外泌体;qRT-PCR和Western Blot检测M2型巨噬细胞的标志蛋白和mRNA表达;（3）外泌体circPIK3R1处理巨噬细胞后收集巨噬细胞条件培养基（TCM）,用TCM处理NSCLC细胞后做Transwell实验,观察NSCLC细胞转移能力,Western Blot检测NSCLC的EMT相关蛋白;在巨噬细胞（M0）中过表达miR-301a或同时过表达circPIK3R1,然后收集TCM处理NSCLC细胞,Transwell实验检测NSCLC细胞转移能力,Western Blot检测NSCLC EMT相关蛋白表达;（4）在巨噬细胞中敲低circPIK3R1,Western Blot检测PTEN/AKT和STAT3信号通路蛋白;在巨噬细胞中敲低circPIK3R1后,再敲低P110γ,Western Blot检测通路相关蛋白;在巨噬细胞中转染circPIK3R1或同时转染miR-301a,然后用IL4和IL13诱导巨噬细胞,Western Blot检测通路相关蛋白。（5）用外泌体miR-301a或同时用外泌体circPIK3R1处理巨噬细胞,将巨噬细胞和A549细胞同时经裸鼠尾静脉注射,6周后取出肺组织,计数肿瘤转移结节,病理切片并H＆E染色,镜下观察并计数肺部肿瘤转移结节。结 果（1）只用Rnase A处理细胞,细胞培养基中circPIK3R1的含量变化不大,但同时用Rnase A和Trion X-100处理细胞,细胞培养基中circPIK3R1的含量明显下降,说明细胞外circPIK3R1主要被膜包裹而不是直接释放到培养基中;电镜可以直观的看到提取的外泌体;粒径分析显示提取的外泌体大小在30-70nm之间,符合外泌体的粒径范围;Western Blot检测到了外泌体的相关标志物,说明本研究提取的外泌体符合要求;（2）外泌体处理巨噬细胞后荧光示踪实验观察到巨噬细胞摄取的外泌体;外泌体 miR-301a 处理组 Arginase-1、CD206、CD163 和 IL-10 的 mRNA 升高,Arginase-1和CD206蛋白表达量增加,而同时用外泌体miR-301a和外泌体circPIK3R1处理组Arginase-1、CD206、CD163 和 IL-10 的 mRNA 下降,Arginase-1 和 CD206 的蛋白表达量降低,说明外泌体circPIK3R1抑制M2型巨噬细胞极化;（3）外泌体miR-301a促进M2型巨噬细胞极化后,M2型巨噬细胞促进了 NSCLC的迁移和侵袭能力,而外泌体circPIK3R1抑制M2型巨噬细胞极化,进而抑制了 M2型巨噬细胞促NSCLC迁移和侵袭的能力;巨噬细胞中过表达miR-301a促进M2型巨噬细胞促NSCLC迁移和侵袭的作用,而巨噬细胞中过表达circPIK3R1抑制M2型巨噬细胞促NSCLC迁移和侵袭的作用;说明外泌体circPIK3R1抑制M2型巨噬细胞极化,进而抑制NSCLC细胞转移。（4）在巨噬细胞中用siRNA敲低circPIK3R1的表达,Western Blot显示PTEN蛋白减少,p-AKT和p-STAT3增加,M2型巨噬细胞标志蛋白CD206也增加;在巨噬细胞中敲低circPIK3R1后再进一步敲低P110γ,结果显示P110γ蛋白减少后,p-AKT、p-STAT3 和 CD206 蛋白表达都降低,说明 circPIK3R1 通过 PI3Kγ/AKT-STAT3通路抑制M2型巨噬细胞极化;巨噬细胞中过表达circPIK3R1后抑制IL4和IL13诱导M2型巨噬细胞极化,巨噬细胞中敲低PTEN蛋白后同样抑制IL4和IL13诱导M2型巨噬细胞极化,说明circPIK3R1通过miR-301a/PTEN轴抑制PI3Kγ/AKT-STAT3通路进而抑制M2型巨噬细胞极化。（5）体内实验外泌体miR-301a组裸鼠的肿瘤肺转移灶数目明显多于外泌体NC组,而同时用外泌体miR-301a和外泌体circPIK3R1处理组肿瘤肺转移灶数目明显低于外泌体miR-301a组。小 结本部分研究发现circPIK3R1存在于外泌体中,可以被巨噬细胞摄取,外泌体circPIK3R1通过miR-301a/PTEN轴抑制PI3Kγ/AKT-STAT3通路进而抑制M2型巨噬细胞极化,从而减弱M2型巨噬细胞促NSCLC细胞转移的作用。结 论本研究首先分析了 circPIK3R1在细胞内的特点,反向引物PCR可以检测到circPIK3R1,Sanger测序证明反向拼接位点的存在。CircRNA由于其环状结构能耐受RNA酶的降解,所以在细胞内半衰期比线性RNA长。大部分由外显子组成的circRNA定位于细胞质,circPIK3R1同样定位于细胞质。对NSCLC组织和细胞株中circPIK3R1表达情况进行分析,发现circPIK3R1明显低表达。而在NSCLC细胞中过表达circPIK3R1,发现circPIK3R1能抑制NSCLC细胞的迁移和侵袭能力,提示circPIK3R1在NSCLC中发挥抑癌基因的作用。进一步机制研究发现,circPIK3R1通过miR-301a/PTEN轴抑制EMT相关蛋白的表达,从而发挥抑制NSCLC转移的作用。另一方面,我们发现circPIK3R1存在于外泌体中,并发现外泌体circPIK3R1在巨噬细胞内通过miR-301a/PTEN轴抑制PI3Kγ/AKT-STAT3通路进而阻止M2型巨噬细胞极化,从而减弱M2型巨噬细胞促NSCLC细胞转移的作用。综上所述,本项目首次报道了 circPIK3R1在NSCLC转移的作用及分子机制,研究成果将有助于深入理解NSCLC肿瘤转移机制,并为NSCLC的治疗提供新的参考。