研究背景脂质代谢紊乱导致的心血管疾病死亡率居高不下。肝脏和血液中甘油三酯、胆固醇和低密度脂蛋白等代谢障碍与动脉粥样硬化、非酒精性脂肪肝的发生发展密切相关。药物降脂仍然是临床主要的治疗策略,其中包括药物（如依折麦布）阻断外源性脂质的肠道吸收或使用他汀类药物来抑制内源性的脂质合成。然而目前临床使用的药物常造成血糖升高、肌肉酸痛、横纹肌溶解、肝肾毒性等副作用,及局部炎症反应等安全性问题,迫切需要新的治疗药物研发与全新的治疗策略发现。近年来,分子印迹技术在生物医学领域的应用为脂质代谢性疾病的治疗提供了新的思路。基于该技术为目标分子量身定制识别位点而合成的分子印迹聚合物（Molecularly imprinted polymers,MIPs）是设计多功能纳米药物的潜在载体。本课题提出利用MIPs对胆固醇或甘油三酯分子的高亲和力和选择性来模仿天然转运体捕获脂质分子,并结合负载抗炎药物或具有纳米酶功能的铈元素构建一体化多功能纳米药物用于改善动物体内脂质代谢紊乱和炎症微环境,从而达到多模态防治脂质代谢相关疾病的目的。研究目的以生物体内的脂质分子为模板,通过筛选疏水性的骨架单体和亲水性的功能单体,运用分子印迹技术合成出能够特异性捕获体内脂质分子的纳米药物,探究其在体内外降脂和抗炎作用,为脂质代谢性疾病的防治策略奠定实验和理论基础。研究方法1、利用高温法合成Ce O2NPs,将其与不同比例的功能单体、交联剂、引发剂、及模板分子胆固醇一同溶于甲苯中,通过表面压印法获得胆固醇-Ce O2@MIPs。用洗脱剂除去模板分子胆固醇后获得纯化的产物Ce O2@MIPs。非分子印迹聚合物（Non-molecularly imprinted polymers,NIPs）在不含目标分子的体系中通过上述相同方法制备获得。2、将不同比例的功能单体,交联剂和印迹目标物甘油三酯溶解于甲苯中,通过沉淀聚合法合成出甘油三酯的仿生转运体MIPs。用洗脱剂除去模板分子甘油三酯,得到纯化后的MIPs。再利用超声法在MIPs的印迹腔中装载疏水性药物槲皮素,纯化得到最终产物QUE@MIPs。3、通过透射电子显微镜和扫描电子显微镜验证不同MIPs的形态学特征。使用马尔文粒径仪测试不同MIPs在水溶液中的表面电位及粒径分布情况。通过傅里叶红外光谱仪测试不同物质的特征吸收峰。利用紫外分光光度计测量药物含量,并绘制浓度-吸光度曲线。用氮气吸附实验分析不同MIPs的孔径情况。使用脂质试剂盒考察不同MIPs对脂质分子的结合常数及其特异性。4、使用巨噬细胞Raw 264.7,分别用脂多糖和氧化低密度脂蛋白/胆固醇刺激,建立细胞炎症和泡沫化模型。分别考察Ce O2@MIPs的抗炎和降脂效果及作用机制。高脂喂养Apo E-/-12周,建立动脉粥样硬化小鼠模型,在动物水平上评估Ce O2@MIPs的治疗效果。5、使用肝癌细胞Hep G-2,分别用脂多糖和甘油三酯刺激建立细胞模型,考察QUE@MIPs在细胞层面的治疗效果及作用机制。用C57BL/J高脂喂养16周建立非酒精性脂肪肝小鼠模型,通过QUE@MIPs进行干预治疗后,评估其治疗效果和作用机制。6、将MIPs加入到含有2%红细胞的悬液中,观察其溶血现象。分别通过口服和尾静脉给予小鼠不同的MIPs进行急性毒性实验考察。在不同时间点记录小鼠的体重和进食量变化。通过鸡尾酒法考察MIPs对肝药酶活性的影响。收集小鼠血液进行生化指标分析,摘取小鼠脏器进行H＆E切片考察器质性损伤情况。研究结果1、具有抗氧化活性的胆固醇仿生转运体Ce O2@MIPs的合成与表征:射电子显微镜结果显示,球形Ce O2NPs的直径为3 nm,具有高度分散性。X射线光电子能谱结果显示Ce O2NPs中的铈元素价态为Ⅲ价态。通过表面压印法在Ce O2NPs表面压印胆固醇分子获得Ce O2@MIPs。透射电子显微镜结果显示,Ce O2@MIPs的直径为5 nm,互相堆积形成小簇。氮气吸附实验结果证实Ce O2@MIPs的孔径为10.63nm。通过傅里叶红外光谱在1650-1730 cm-1的吸收峰判断Ce O2@MIPs成功印迹了胆固醇,并且在胆固醇洗脱后保留了印迹空穴。2、基于货物交换策略的甘油三酯仿生转运体QUE@MIPs的合成与验证:透射电子显微镜结果显示QUE@MIPs呈现高度均一的球形结构,直径为400 nm,具有良好的分散性。从扫描电子显微镜结果可以看到MIPs表面的凹槽结构。结合氮气吸实验测试的MIPs的表面孔径大小为4 nm,充分证实了MIPs表面的印迹腔的存在。傅里叶红外光谱结果显示载药后出现了槲皮素的酚羟基的伸缩振动峰。通过马尔文粒度仪测试了槲皮素及QUE@MIPs的粒径大小,结果提示MIPs提高了槲皮素在水中的分散性。Zeta电位检测结果显示QUE@MIPs表面电位为-34.3±1.8 e V,证实了QUE@MIPs具有良好的稳定性。3、不同仿生转运体MIPs均具有良好的细胞安全性。Ce O2@MIPs处理后,有效降低了细胞泡沫化,并减少了胞内胆固醇和ROS水平。Ce O2@MIPs在转录和翻译层面减少了炎症因子的表达,同时也抑制了炎症引起的细胞迁移和过量ROS引起的细胞凋亡。此外,经QUE@MIPs干预治疗的脂质化Hep G-2细胞,胞内脂质代谢相关蛋白的表达增加,促进了甘油三酯的代谢。并且细胞内的炎症反应得到有效控制。4、在Apo E-/-动脉粥样硬化模型小鼠中,通过荧光分子标记Ce O2@MIPs来追踪Ce O2@MIPs的体内动向,结果证实Ce O2@MIPs可以有效富集在主动脉斑块部位。与高脂对照组相比,经过Ce O2@MIPs干预治疗后的小鼠主动脉窦斑块面积减小了47.99%,坏死核心面积减小到6.77%,有效缓解了动脉粥样硬化的病程进展。5、尤斯室实验结果证实MIPs显著提高了QUE的透肠吸收效率。在C57BL/J非酒精性脂肪肝小鼠模型中,经过QUE@MIPs的干预后,小鼠肝脏的脂质水平明显降低,并减少了炎症因子的表达水平。小鼠的血脂浓度和脂肪垫重量均有降低。QUE@MIPs对非酒精性脂肪肝的进展有显著的抑制效果。6、MIPs与红细胞共孵育,未观察到溶血现象。小鼠急性毒性试验显示MIPs不影响小鼠的进食量和体重。考察MIPs组和生理盐水组血常规项下的肝功和肾功,各组间差异无统计学意义。主要脏器的H＆E染色切片显示MIPs不引起器质性损伤。虽然MIPs会引起部分肝药酶活性降低,但只要剂量合适,避免药物的不合理配伍,可以降低其副作用的发生。研究结论1.利用分子印迹技术合成了针对生物体内脂质小分子的仿生转运体。所制备的仿生转运体对脂质分子具有良好的识别能力,在生理环境下具有良好的稳定性和抗干扰能力。2.合成的MIPs具有低细胞毒性,能够借助纳米尺寸效应促进脂质的细胞外排,有效逆转了细胞脂质化水平。同时,通过表面压印法合成的MIPs被赋予了广泛的抗炎、抗氧化活性。3.基于货物交换策略设计的MIPs,其疏水性印迹腔体作为药物槲皮素的递送载体,完美解决了药物口服生物利用度低和分散性差的问题。当MIPs作用于脂质分子时,可以在亲和力的驱动下发生货物交换,实现在病灶部位定点释放药物。3.针对小鼠动脉粥样硬化模型,通过尾静脉给药,Ce O2@MIPs可利用渗透效应被动靶向在血管斑块部位发挥治疗作用。待特异性捕获胆固醇后利用纳米尺寸效应促进胞内胆固醇外排,并启动抗炎机制,降低斑块内的炎症反应,在一定程度上有效抑制了动脉粥样硬化的发生发展。4.针对非酒精性脂肪肝动物模型,通过口服给药的方式,QUE@MIPs被有效吸收入血,并通过网状内皮系统被运输到肝脏发挥药效。作为甘油三酯的仿生转运体,QUE@MIPs特异性的结合肝细胞内的甘油三酯。同时,通过货物交换策略,释放药物槲皮素,发挥抗炎疗效,最终有效逆转了非酒精性脂肪肝的发生。该策略有望被借鉴用于治疗其他脂质代谢性疾病。