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慢性髓细胞白血病（Chronic Myeloid Leukemia,CML）是一种恶性血液肿瘤,其特征是9号和22号染色体之间相互易位。这种易位产生了bcr-abl基因,该基因编码具有组成性酪氨酸激酶活性的BCR-ABL癌蛋白可导致CML的发生。尽管酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitor,TKI）的代表药物伊马替尼可使慢性髓细胞白血病患者获益,并在临床上得到了广泛应用,然而,伊马替尼耐药尤其是涉及融合蛋白激酶区T315I突变的耐药仍然是CML治疗的主要障碍。因此,迫切需要探索更有效的治疗策略。免疫治疗改善了血液肿瘤的治疗现状。BCR-ABL是CML的特异性癌蛋白,因此BCR-ABL及其突变型BCR-ABLT315I是CML免疫治疗的特异性靶抗原。但其位于细胞质而非细胞膜上,无法被嵌合抗原受体修饰的T细胞（Chimeric antigen receptor T-cell,CAR T）免疫疗法识别。先前的研究表明负载抗原的树突状细胞（Dendritic cell,DC）来源的外泌体（Dendritic cell-derived exosomes,Dex）可以诱导抗肿瘤免疫效应。然而,基于Dex的临床试验表明尽管它能有效地诱导NK细胞活化,仅观察到微弱的T细胞反应,致使其临床疗效有限。因此,需要探索新的方法来生成能够诱导T细胞和NK细胞均激活的Dex。RAE-1γ（Retinoic acid early inducible-1γ,RAE-1γ）是NK和T细胞表达的NK细胞杀伤受体2（Natural killer group 2 member D,NKG2D）的关键配体,可激活NK细胞并为T淋巴细胞的活化提供共刺激信号。此外,肿瘤细胞裂解物作为有效的抗原供体,可以为DC提供足够的肿瘤抗原并诱导强免疫应答。因此,本研究旨在通过DC负载表达RAE-1γ的CML细胞裂解物来收集富含RAE-1γ的CML特异性Dex（CML-RAE-1γ-Dex）,同时研究其激活T细胞和NK细胞并在体外和体内诱导有效的抗CML效应。方法:1.表达RAE-1γ的CML特异性的Dex（CML-RAE-1γ-Dex）的制备。以表达bcr-abl/P210蛋白的鼠源性细胞（BP210）和表达bcr-abl/P210激酶区T315I突变的鼠源性细胞（BP210-T315I）为模型,通过转染表达RAE-1γ或对照的慢病毒,建立表达RAE-1γ的CML细胞（BP210-RAE-1γ）和T315I突变的CML细胞（BP210-T315I-RAE-1γ）或对照细胞BP210-mock或BP210-T315I-mock。获取肿瘤细胞裂解物刺激DC后分离得到Dex。利用透射电子显微镜（Transmission electron microscopy,TEM）和纳米颗粒追踪分析（Nanoparticles Tracking Analysis,NTA）检测其形态和大小分布。免疫印迹检测RAE-1γ在CML-RAE-1γ-Dex中的表达。2.检测CML-RAE-1γ-Dex对NK/T细胞的免疫刺激活性和经刺激后的NK/T细胞对BP210细胞和BP210-T315I细胞的杀伤能力。新鲜分离的小鼠NK细胞或T淋巴细胞分别与PBS、Dex、BP210-mock-Dex、BP210-RAE-1γ-Dex、BP210-T315I-mock-Dex和BP210-T315I-RAE-1γ-Dex共同培养。经流式细胞术检测这些免疫细胞中CD69、CD107a、穿孔素和颗粒酶B（Granzyme B,Gzm B）的表达评估免疫细胞的活化。流式细胞术检测NK细胞、CD4+和CD8+T细胞的增殖活性。通过ELISPOT和LDH实验分别检测这些免疫细胞的细胞因子如TNF-α和IFN-γ产生情况和对靶细胞BP210和BP210-T315I的杀伤能力。经流式细胞术检测NKG2D阻断后CML-RAE-1γ-Dex刺激的NK细胞、CD4+和CD8+T细胞活化水平的变化.3.CML-RAE-1γ-Dex在表达BCR-ABL或BCR-ABLT315I的细胞诱导的小鼠白血病模型中的免疫治疗效应和免疫记忆效应。经尾静脉注射BP210或BP210-T315I细胞至Balb/c小鼠体内建立CML模型。一周后,给小鼠皮内注射Dex、CML-mock-Dex、CML-RAE-1γ-Dex或等体积的PBS。每两天一次,治疗一个月。监测小鼠外周血白细胞计数。当小鼠出现弓背、跛行和体重骤降时处死。制备骨髓涂片和肝脾组织印片,瑞氏染色检测白血病细胞在这些组织中的浸润。H＆E染色肝脾组织切片用来观察白血病细胞在肝脾组织中的浸润。用免疫荧光实验检测癌蛋白BCR-ABL在骨髓及肝脾组织中的表达。采用Kaplan-Meier生存法比较各组间的生存差异。90天后,我们用对应的BP210或BP210-T315I细胞再次接种经CML-RAE-1γ-Dex治疗后存活的小鼠。将新购小鼠分别接种BP210或BP210-T315I细胞作为Blank对照组。观察指标如上所述。结果:1.成功制备CML-RAE-1γ-Dex。流式细胞术分析证实RAE-1γ在BP210-RAE-1γ（88.3±6.5%）和BP210-T315I-RAE-1γ细胞（89.0±4.4%）上高表达。成功从负载细胞裂解物的DC分离出的外泌体经TEM观察到其呈典型的杯状,NTA检测到其直径在30到150nm之间。此外,免疫印迹表明与mock组相比,CML-RAE-1γ-Dex高表达RAE-1γ（BP210-RAE-1γ-Dex组:9.4±3.2倍vs 1.5±0.5倍,BP210-T315I-RAE-1γ-Dex组:9.0±3.0倍vs 1.2±1.0倍）。2.CML-RAE-1γ-Dex在体外诱导NK细胞和T细胞活化和增殖,并促进NK细胞和T细胞对靶细胞BP210及BP210-T315I的杀伤能力。流式细胞术分析显示CML-RAE-1γ-Dex可促进NK细胞、CD4+和CD8+T细胞中CD69的表达。流式细胞术结果显示CML-RAE-1γ-Dex刺激分别增加NK细胞、CD4+和CD8+T细胞中CD107a、穿孔素和Gzm B的表达。流式细胞术分析表明CML-RAE-1γ-Dex可以促进NK细胞、CD4+和CD8+T细胞的增殖能力。ELISPOT分析表明经CML-RAE-1γ-Dex刺激后,NK细胞和T淋巴细胞产生更多TNF-α和IFN-γ。LDH实验表明经CML-RAE-1γ-Dex处理的NK细胞和T淋巴细胞分别对BP210和BP210-T315I细胞具有强杀伤效应。NKG2D阻断后CML-RAE-1γ-Dex诱导NK细胞、CD4+和CD8+T细胞产生Gzm B的能力减弱。3.CML-RAE-1γ-Dex在体内诱导抗肿瘤活性和长期的免疫保护效应。与mock组的小鼠相比,CML-RAE-1γ-Dex治疗后小鼠外周血白细胞减少（BP210-RAE-1γ-Dex组:9.8±1.2（×10~9/L）vs 21.6±3.5（×10~9/L）,BP210-T315I-RAE-1γ-Dex组:9.6±1.5（×10~9/L）vs 23.5±5.3（×10~9/L））,肝脾肿大被抑制。Wright和H＆E染色也证实白血病细胞在骨髓、肝脏和脾脏组织中的浸润减轻。免疫荧光实验表明CML-RAE-1γ-Dex可降低骨髓、肝脏和脾脏组织中癌蛋白BCR-ABL的表达。最后生存分析表明CML-RAE-1γ-Dex延长小鼠的存活时间至90天。即使面临白血病细胞BP210和BP210-T315I的第二次攻击,类似的结果也可在存活的小鼠中观察到。结论:综上所述,我们成功分离出表达RAE-1γ的CML特异性的Dex（CML-RAE-1γ-Dex:BP210-RAE-1γ-Dex和BP210-T315I-RAE-1γ-Dex）。CML-RAE-1γ-Dex通过NKG2D/配体途径增强NK细胞、CD4+和CD8+T细胞的增殖和免疫活性,在体外和体内模型中诱导产生了强大的抗CML作用。此外,基于CML-RAE-1γ-Dex的免疫治疗可在体内抑制白血病发生,并诱导长期免疫保护（观察期90天）。更重要的是,BP210-T315I-RAE-1γ-Dex对伊马替尼耐药的BP210-T315I细胞也有效。因此,CML-RAE-1γ-Dex可能是治疗CML,尤其是T315I突变的CML的一种有希望的策略。