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兜兰(Paphiopedilum)由于独特的花朵造型、绚丽的花朵色彩、持久的观赏花期而具有极高的观赏价值,是国际上栽培最广泛的兰花之一。由于生态环境的破坏、人们对其过度的采挖及其繁殖困难,兜兰现已成为世界上最濒危的植物物种之一,许多种类已濒临灭绝,所有野生种均被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)附录Ⅰ而被禁止交易。进行兜兰属植物的资源保护和可持续利用十分必要和迫切。因此,本论文根据标本馆中兜兰的标本收集,应用数学模型对植物进行了濒危性分析;系统地进行兜兰属植物的引种驯化和迁地保护;利用无菌播种和组织培养技术繁殖了大量的兜兰种苗应用于商品生产和自然回归;通过杂交育种培育出了兜兰新品种;开展了兜兰微卫星引物开发和遗传多样性分析研究。主要研究结果如下:
1.中国兜兰属植物的濒危性分析。利用索罗方程、视率方程、罗宾森和威洛克方程,及全球中国兜兰的标本数据分析了18种产于中国的兜兰属的濒危度,并分析了与中国植物红色名录所定的濒危级别的相关性,其结果基本一致,但中国植物红色名录中定为濒危级别(EN)的紫纹兜兰和紫毛兜兰应定为极危(CR)级别。
2.兜兰属植物的引种和适应性评价。2003年至2011年期间,对兜兰属植物进行了较为系统的引种。原产于中国的兜兰中,除近年来发表的4个新种外,我们已引种到其余的27种兜兰并栽培于华南植物园兰花保育温室中,所引种的种类均已成活且开花,但杏黄兜兰、硬叶兜兰、白花兜兰等生长状况较差、开花率低。所引种的44种原产于国外的兜兰均已栽培成活,36种已开花。利用灰色关联度对产于中国的27种兜兰进行了观赏价值评估和适应性分析得出,飘带兜兰是最值得在华南地区栽培的兜兰种类,其次为白旗兜兰;杏黄兜兰、硬叶兜兰、白花兜兰不适于华南地区栽培。
杏黄兜兰、硬叶兜兰在华南地区温室中栽培时,叶片显著性地变小,而麻栗坡兜兰的叶片显著变大;杏黄兜兰单位面积的气孔变少,而硬叶兜兰和麻栗坡兜兰的单位面积的气孔变化不大。引种3年后,3种兜兰的叶绿素和类胡萝卜含量均显著性地升高,但它们的净光合速率降低。
3.兜兰属植物的无菌播种和组织培养。对彩云兜兰的无菌播种进行了系统的研究。授粉后180 d的彩云兜兰种子在1/2MS或N026中附加0.5 mg l-1 NAA、100ml l-1椰子汁、1.0gl-1活性炭和20gl-1蔗糖培养基上萌发率最高;利用0.5%有效氯溶液处理授粉后360 d的成熟种子60 min,能将种子的萌发率从10.33%提高到70.33%; Hyponex N016培养基中补充1.0 g l-1 peptone、1.0 mg l-1NAA、30 g l-1蔗糖、1.0 g l-1 AC和100 g l-1香蕉汁适合生根和壮苗;以植金石、泥炭土和碎树皮(体积比为2∶1∶1)的混合基质移栽试管苗60 d时成活率达到95%。彩云兜兰试管苗出瓶移栽180 d后,再将他们回归到广东省阳春市鹅凰嶂自然保护区中进行自然栽培,2年后,回归移栽成活率高达60.33%,部分野生回归的植株已开花。本研究也利用彩云兜兰的最佳培养基完成了其它36种兜兰的无菌播种试验并获得试管苗。
利用无菌播种获得的汉氏兜兰的原球茎和试管苗顶芽为外植体进行兜兰的组织培养研究。以原球茎为外植体时,1/2MS附加5.0 mg l-12,4-D和1.0 mgl-1TDZ适合愈伤组织的诱导和增殖;1/2MS附加5.0 mg l-1 KT和0.5 mg l-1 NAA适合愈伤组织的分化;1/2MS附加5.0 mg l-1 KT和0.5 mg l-1 NAA培养基适合类原球茎的增殖;H016培养基中添加1.0 g l-1 peptone,30 g l-1蔗糖,1.0 g l-1 AC,1.0-2.0 mg l-1NAA和100 g l-1的香蕉汁适合类原球茎的分化、生根和壮苗。以顶芽为外植体时,1/2MS附加1.0 mg l-1 BA和2.0 mg l-1 NAA适合丛生芽的诱导和增殖。
4.兜兰属植物的杂交育种。将彩云兜兰、杏黄兜兰、同色兜兰、麻栗坡兜兰、带叶兜兰、长瓣兜兰的花粉4℃低温干藏1年,45%的杏黄兜兰花粉还具有活力,其它种类50%的花粉具有活力。以彩云兜兰、长瓣兜兰、麻栗坡兜兰和同色兜兰的新鲜花粉或4℃低温贮藏的花粉与29种兜兰、南美兜兰、云南火焰兰、白花蝴蝶兰等进行杂交,结果发现,兜兰属间杂交亲和性高,属间杂交亲和性低。与云南火焰兰、白花蝴蝶兰的杂交未获得成功;彩云兜兰、长瓣兜兰和同色兜兰同南美兜兰的杂交获得成功;利用杓兰的花粉和麻栗坡兜兰杂交获得了种子,但未能萌发。
5.同色兜兰的微卫星引物开发。以3个群体30个同色兜兰个体为材料,利用磁珠富集法,扩增到10对具有多态性的微卫星位点,由10个位点设计出的SSR引物扩增片段大小介于114-241 bp之间,每个位点有3-12个等位基因(平均每个位点有6.4个等位基因),其期望杂合度(HE)为0.200-0.800,观测杂合度为0.544-0.827,表现出了较高的多态性。利用这些特异性微卫星位点引物对同色兜兰、文山兜兰和巨瓣兜兰进行了遗传多样性分析可知,同色兜兰同巨瓣兜兰的遗传距离较远,文山兜兰同巨瓣兜兰的亲缘关系较近,位点之间较少交叉,可旁证文山兜兰不是同色兜兰和巨瓣兜兰的杂交种而能单列成种。