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目的:观察姜黄素及三氧化二砷对K562细胞增殖及凋亡影响,以及两者联合应用对K562细胞增殖及凋亡的作用,探讨不同靶点药物联合对白血病细胞的作用。
方法:采用四唑盐(MTT)比色法检测姜黄素及三氧化二砷对K562细胞增殖的影响,以及两者联合应用对K562细胞增殖的影响;Annexin-V FITC/PI双染流式细胞仪检测姜黄素、三氧化二砷单用及联合对K562细胞凋亡的影响。两种药物联用后是否有协同作用可按金氏公式计算q值:q=D1+2/(D1+D2-D1×D2),D1+2是指两药联合作用时的抑制率,D1,D2分别只单药作用时的抑制率。当q值大于1.15表示有协同作用,小于0.85表示拮抗作用,在0.85和1.15之间表示相加作用。
结果:
1.姜黄素和As2O3对K562细胞的生长抑制作用
姜黄素终浓度为20.0μmol/L孵育48小时,K562细胞的生长抑制率为25.996±3.146%,姜黄素为0浓度时为对照。姜黄素对K562细胞作用48h后IC50为71.61μmol/L。加入终浓度为8.0μmol/L三氧化二砷孵育48小时,K562细胞的生长抑制率为43.426±4.211%,三氧化二砷浓度为0时作对照。三氧化二砷对K562细胞作用48h后IC50为12.05μmol/L。结果显示姜黄素和三氧化二砷对K562细胞生长均明显的抑制作用。
2.姜黄素和As2O3对K562细胞的生长抑制的时间依赖关系观察
终浓度为40.0μmol/L姜黄素以及终浓度为8.0μmol/L三氧化二砷分别加入K56细胞培养中,孵育24、48小时,观察药物对K562细胞抑制的时间依赖关系。结果在加姜黄素组在孵育24、48小时,抑制率分别为13.996±3.847%和25.996±3.146%。三氧化二砷组孵育24、48小时,抑制率分别为24.426±3.942%和43.426±4.211%,可见随孵育时间延长,姜黄素及三氧化二砷对K562细胞的生长抑制率增高。
3.姜黄素和As2O3对K562细胞的生长抑制的剂量依赖关系
姜黄素终浓度分别为0、5.0μmol/L、10.0μmol/L、20.0μmol/L、40.0μmol/L,以及三氧化二砷终浓度分别为2.0μmol/L、4.0μmol/L、8.0μmol/L、16.0μmol/L,与K562细胞孵育48小时。分别观察姜黄素和三氧化二砷浓度变化对K562细胞生长影响。结果见随着姜黄素和三氧化二砷浓度增加,对K562细胞的抑制率增高。
4.三氧化二砷增强姜黄素对K562细胞的生长抑制作用
不同浓度的姜黄素5.0-40.0μmol/ml与As2O32μmol/ml联合作用于K562细胞,孵育48小时后观察生长抑制率,测定As2O32对姜黄素作用的影响。结果:姜黄素联合As2O3对K562的抑制作用明显高于单药处理组,且不同药物浓度组的q值均大于1.15(p<0.05),提示两药联合对K562均能产生协同抑制的作用。
5.三氧化二砷增强姜黄素诱导K562细胞凋亡
在姜黄素浓度为5.0、10.0、20.0、40.0 umol/L时加三氧化二砷2.0umol/L作用于K562细胞48小时后,通过AnnexinV-FITC/PI法测定单药及联合后K562的凋亡率。在姜黄素0、5.0、10.0、20.0、40.0 umol/L时凋亡率分别为0.76%、6.84%、12.21%、22.5%、29.87%,加三氧化二砷2.0umol/L时,凋亡率均有明显的增高,两两比较差异有非常显著性意义(q>1.15,p<0.01)。结果示三氧化二砷能增强姜黄素诱导K562凋亡的作用。
通过Hoechst33258 DNA染色法观察K562细胞凋亡,三氧化二砷(2.0umol/L)、姜黄素(20.0 umol/L)作用于K562细胞48小时后,经Hoechst33258染色观察,姜黄素、三氧化二砷、联合作用组细胞核内的染色质出现凝聚、边缘化,部分细胞核裂解为碎块,出现凋亡小体。三氧化二砷和姜黄素联合组凋亡细胞明显高于单药组及对照组。
结论:
姜黄素体外能抑制K562细胞增殖以及诱导K562细胞凋亡。姜黄素作用随药物浓度增加和作用时间延长而增强。
三氧化二砷在体外明显增强抑制K562细胞增殖以及诱导K562细胞凋亡。三氧化二砷作用随药物浓度增加和作用时间延长而增强。
三氧化二砷联合姜黄素,有明显增强对K562细胞生长抑制以及增强诱导细胞凋亡作用。