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背景:皮肤作为人体最大的器官,维持着人体内外环境的平衡。当皮肤的正常解剖结构和功能完整性发生紊乱时,在机体自身的保护机制下,将启动一系列与创面愈合相关的生理和病理修复机制。愈合是一种复杂而动态的细胞信号反应,是一种由止血、炎症、增殖、迁移和重塑等重叠阶段组成的生物和分子活动,以实现组织修复。损伤发生后,脂肪组织可以促进恢复原始组织结构,其机制可能与ADSCs内含丰富的分泌体有关,这些分泌体已被证实在细胞增殖、分化、迁移和改善细胞与细胞外微环境之间联系中发挥重要的作用。外分泌体具有与干细胞类似的功能,其富含蛋白质、mRNA、miRNA和其他物质,少数miRNA被报道在愈合过程中发挥作用。miRNA为近年来一研究热点,但是关于外泌体分泌的miRNA在皮肤损伤愈合过程中的作用研究较少。目的:本研究主要探讨ADSCs源性外泌体分泌的miR-486-5p在皮肤损伤愈合中的作用及其机制,并为用于临床治疗提供理论基础。方法:本课题中主要使用的实验包括小鼠皮肤损伤模型、组织免疫荧光和HE染色、Masson三色染色、细胞转染技术、CCK8、蛋白免疫印迹实验、划痕实验、迁移实验和小管形成实验等。结果:1.ADSCs源性外泌体促进皮肤创面愈合与血管新生该部分实验首先从手术组织中分离脂肪干细胞(ADSCs),并检测相关蛋白(CD105、CD44、CD73等)。茜素红、油红O、阿尔西亚蓝染色实验呈现的颜色,显示我们分离出的ADSCs细胞具有分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的潜能。外泌体粒径检查与电镜检查提示获取粒子为外泌体。小鼠背部皮肤切割的损伤模型发现注射外泌体组的创面愈合较快,注射PBS液体的对照组愈合较慢。另外HE染色结果显示,注射外泌体组的小鼠皮肤创面基本已闭合,且已出现新生的皮肤、毛发滤泡和脂肪细胞,而PBS组无明显的变化。Masson三色染色结果显示,相比PBS组,外泌体组皮肤创面表层的胶原纤维组织明显增加。小鼠皮肤创面免疫荧光实验发现外泌体注射组CD31阳性细胞明显增加,血管组织增多。2.ADSCs源性外泌体内miR-486-5p促进HSF和HMEC细胞增殖、迁移和血管形成本实验通过PKH67标记ADSCs源性外泌体,并且通过基因转染技术转染miR-486-5p mimic或Inhibitor,结果显示ADSCs源性的外泌体被HSF和HMEC细胞内吞,HSF和HMEC细胞内miR-486-5p表达增高。另外,我们使用转染miR-486-5p mimic或者使用ADSCs源性外泌体,相比miR-486-5p Inhibitor或PBS组,发现细胞迁移能力明显增强。CCK8实验发现ADSCs源性外泌体可促进HSF细胞增殖,而miR-486-5p inhibitor可以抑制细胞的增殖能力。小管形成实验发现,ADSCs外泌体组和miR-486-5p mimic组小管的长度和分支明显增加,而miR-486-5p Inhibitor组小管形成明显较弱。3.ADSCs源性外泌体分泌的miR-486-5p通过抑制Sp5的表达促进HSFs增殖、迁移和HMECs血管生成双荧光素酶报告基因实验结果显示,相比mimic对照组与Sp5 3’-UTR共转,miR-486-5p mimic与Sp5 3’-UTR野生型质粒共转时荧光信号明显增强;而共转mimic对照和Sp5 3’-UTR突变组以及mimic和Sp5 3’-UTR突变组,荧光信号无改变。此外,在HSF细胞和HMEC细胞转染miR-486-5p mimic和Inhibitor时结果显示,转染mimic时,miR-486-5p表达升高,Sp5蛋白表达下降;而转染Inhibitor时,miR-486-5p表达下降,Sp5蛋白表达升高。划痕实验中,当转染Sp5过表达质粒和使用PBS处理后,相比转染pcDNA-3.1对照组质粒,细胞的迁移率明显减小,而转染Sp5过表达质粒和ADSCs源性外泌体,细胞的迁移率较转染Sp5过表达质粒组和PBS组明显增加,同时,细胞增殖能力呈现类似的趋势。小管形成实验发现转染Sp5过表达质粒细胞的小管形成能力减弱,而在经外泌体处理后,细胞的血管形成能力增加。4.miR-486-5p促进小鼠皮肤损伤愈合皮肤损伤模型分为三组:ADSCs外泌体+miR-486-5p NC组、PBS+miR-486-5p NC组和PBS+miR-486-5p拮抗剂组。ADSCs外泌体+miR-486-5p NC组皮肤创面愈合速度最快,PBS+miR-486-5p NC组次之,注射PBS+miR-486-5p拮抗剂组创面愈合最慢。HE染色发现新生的皮肤、新生的毛发囊泡和脂肪细胞在ADSCs外泌体+miR-486-5p NC组明显增多,这些新生组织在PBS+miR-486-5p拮抗剂组明显较少;新生上皮组织和疤痕定量分析,发现ADSCs外泌体+miR-486-5p NC组疤痕和新生上皮宽度明显较大,注射miR-486-5p拮抗剂后出现相反的结果。Masson三色染色实验发现,ADSCs外泌体+miR-486-5p NC组小鼠皮肤创面明显可见胶原纤维沉积,对照组胶原纤维明显减少。免疫荧光发现ADSCs外泌体+miR-486-5p NC组皮肤组织中CD31荧光明显增强,miR-486-5p拮抗剂组CD31荧光较弱。5.miR-486-5p通过结合Sp5调节CCND2表达,继而促进血管形成经ADSCs源性外泌体处理后,CCND2蛋白表达明显较PBS处理增加;经PBS和siCCND2处理后,细胞内CCND2蛋白表达明显减少,而经外泌体处理后细胞CCND2表达增加。另外划痕实验、迁移实验发现经siCCND2和PBS处理的细胞细胞迁移能力明显下降,而经外泌体处理后细胞的迁移能力增强。同样我们发现CCK8实验呈现类似的表现,该实验说明ADSCs源性外泌体可通过调控CCND2蛋白的表达而调控细胞增殖。小管形成实验发现siCCND2小干扰可抑制小管形成,小管的长度和数目明显减少,再经外泌体处理,细胞的小管形成能力增加。结论:1.ADSCs源性外泌体可促进皮肤创面愈合与血管新生2.ADSCs源性外泌体内miR-486-5p促进HSF和HMEC细胞增殖、转移和血管形成3.ADSCs源性外泌体分泌的miR-486-5p通过抑制Sp5的表达促进HSFs增殖、迁移和HMECs血管生成4.miR-486-5p可促进小鼠皮肤损伤愈合5.miR-486-5p通过结合Sp5调节CCND2表达,继而促进血管形成