代谢综合征是一组以胰岛素抵抗为病理基础的代谢紊乱征候群,主要包括肥胖症、脂代谢异常、高血压、高尿酸血症等,是多种代谢异常在机体内集结的病理状态。流行病学研究结果显示,代谢综合征发病率大幅度增加与长期果糖过量摄入呈正相关。高果糖摄入可引起胰岛素抵抗、高胰岛素血症、高血脂症、肥胖症、高尿酸血症等代谢综合征病理特征,并伴随氧化应激、胰岛素敏感性降低、炎症反应与脂质沉积等肝脏损伤,但高果糖摄入引起肝损伤分子病理机制尚需进一步阐明。高果糖可导致人类和动物全身性和肝脏等多器官胰岛素敏感性降低,并破坏机体脂质平衡。固醇调节元件结合蛋白(SREBP-1c)可抑制胰岛素受体底物2(IRS2)表达,下调蛋白激酶B (Akt)磷酸化水平从而引起肝脏胰岛素敏感性降低。SREBP-1c还可调节脂肪酸合成酶(FAS)表达。脂质转运相关蛋白ATP结合盒转运蛋白Al (ABCA1)也可调控肝脏脂质转运,并与SREBP-1c有一定关联。胰岛素诱导基因1(Insig-1)与去乙酰化酶(Sirtl)可抑制SREBP-1c活性以调节脂代谢。MicroRNAs (miRNAs)是一类非编码、长度在18-24个核苷酸的RNA,其中miR-29b和miR-34a具有调控胰岛素信号通路、脂质代谢等生理功能。有学者研究证实糖尿病模型小鼠肝脏miR-29b表达水平显著上调；在非酒精性脂肪肝(NAFLD)患者血清、及非酒精性脂肪肝炎(NASH)患者、肥胖症和糖尿病小鼠肝脏上也观察到miR-34a表达水平显著升高。据targetscan数据库(http://www.targetscan.org/)预测,miR-29b和miR-34a分别与insig-1和SirtlmRNA3’非编码区结合。高果糖是否上调miR-29b和miR-34a表达水平而影响肝脏insig-1和Sirtl表达使SREBP-1c及相关胰岛素信号通路受损、脂合成与转运相关蛋白表达异常,从而造成肝脏脂质沉积?另外,高果糖诱导所产生的活性氧(ROS)也加重肝脏炎症与损伤。硫氧还原蛋白(TRX)及其内源性抑制剂硫氧还原蛋白相互作用蛋白(TXNIP)可调节细胞内氧化还原平衡。过氧化氢(H202)作为ROS重要组成可刺激人单核细胞促进TXNIP与TRX解离,并激活NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体促进炎症细胞因子IL-1β成熟。本课题组前期已建立10%果糖水喂养大鼠诱导产生代谢综合征动物模型,观察到该模型动物肝脏和或肾脏高水平ROS和H202,并伴随TXNIP/NLRP3炎症小体的激活与IL-1p成熟。有学者观察到NAFLD小鼠肝脏miR-200a表达水平显著下降,而H202氧化应激可调节人类巨噬细胞miR-200a表达,且miR-200a据targetscan数据库预测可与TXNIP mRNA3’非编码区结合。高果糖所引起的高水平H2O2是否有可能降低miR-200a表达而提高TXNIP,以激活NLRP3炎症小体产生IL-1β而诱导肝脏炎症?临床和或基础研究已证实中药有效成分二苯乙烯类化合物紫檀茋(Pterostilbene)和姜黄素(Curcumin)可改善胰岛素抵抗、高胰岛素血症,高血脂症及糖尿病并发症等,且具有良好的肝保护作用。本课题组前期研究发现紫檀茋可减轻高果糖代谢综合征大鼠病理特征,但对肝脏胰岛素敏感性的降低与脂质沉积的改善作用及其分子作用机制尚需进一步阐明。姜黄素也可减轻高果糖代谢综合征大鼠肝脏损伤,但其如何逆转高果糖所导致肝脏氧化应激与炎症反应及其可能的分子作用机制尚需进一步研究。本文在高果糖饮食诱导产生代谢综合征大鼠肝损伤及高果糖刺激肝细胞模型上,进一步探索高果糖是否上调miR-29b和miR-34a表达水平而影响肝脏insig-1和Sirtl表达,使SREBP-1c及相关胰岛素信号通路受损、脂合成与转运相关蛋白表达异常,以探询高果糖造成肝脂质沉积新的途径；并分析高果糖所引起高水平H202是否降低miR-200a表达水平而激活TXNIP/NLRP3炎症小体促进IL-1β产生,以发现高果糖诱导肝脏炎症新的病理机制。继之,在这些动物和细胞模型上重点研究紫檀茋对肝脏胰岛素敏感性降低与脂质沉积的改善作用及其分子作用机制,分析姜黄素对肝脏氧化应激与炎症反应的修复作用及其分子作用机制。本文建立了代谢综合征大鼠模型。10%果糖水喂养雄性Sprague-Dawley大鼠连续12周；从动物造模第7周始,分别灌胃给予紫檀茋(10、20和40mg/kg)、姜黄素(15、30和60mg/kg)、吡格列酮(4mg/kg,阳性对照药)及别嘌呤醇(5mg/kg,阳性对照药)6周。与正常组比较,口服葡萄糖耐量试验(OGTT)与胰岛素耐量试验(ITT)结果证实该模型动物葡萄糖耐量与胰岛素敏感性降低,同时大鼠体重、血清胰岛素、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、尿酸与IL-1β水平均显著升高。与模型对照组比较,紫檀茋、姜黄素、毗格列酮与别嘌呤醇均可显著降低果糖代谢综合征大鼠体重、血清胰岛素、TG、TC、 LDL-C、尿酸与IL-1β水平。在上述研究工作基础上,本文首先探询高果糖是否上调miR-29b和miR-34a表达而影响肝脏insig-1和Sirtl表达使SREBP-1c相关胰岛素信号通路受损、脂合成与转运相关蛋白表达异常,从而造成肝脏脂质沉积?以及紫檀茋通过什么途径改善肝脏脂质沉积及其可能的分子作用机制。与正常组比较,高果糖模型大鼠肝脏TG和TC水平升高、肝脏脂质沉积加重,伴随SREBP-1c和FAS蛋白水平升高、及ABCA1蛋白水平降低；在体外高果糖(5 mM)细胞模型上也观察到SREBP-1c(大鼠肝细胞系BRL-3A:12 h;人类肝癌细胞系HepG2:8h)和FAS蛋白水平上调与ABCA1蛋白水平下调及脂质沉积(BRL-3A:24 h; HepG2:12 h)。另外,该模型动物呈现胰岛素信号受损,即IRS2蛋白水平和Akt磷酸化水平显著降低,并在体外细胞模型上获得证实(BRL-3A:12 h; HepG2:8h)。这些实验结果提示高果糖可诱导大鼠肝脏与肝细胞胰岛素信号损伤及脂质调节异常,造成脂质沉积。与模型对照组比较,紫檀茋与吡格列酮均可上调动物和细胞模型IRS2和p-Akt磷酸化蛋白水平,降低SREBP-1c和FAS蛋白水平并增加ABCA1蛋白水平,减轻脂质沉积。与正常组比较,高果糖模型大鼠肝脏和肝细胞BRL-3A (12 h)和HepG2 (8 h) insig-1和Sirtl蛋白水平显著降低,而紫檀茋与吡格列酮具有显著逆转作用。经miRNAs基因芯片分析发现模型动物肝脏miR-29b与miR-34a表达水平显著高于正常组,这一结果并被qPCR验证。与正常细胞组比较,高果糖可上调]miR-29b与miR-34a表达水平(BRL-3A:12h;HepG2:8h)。与果糖模型对照组比较,紫檀茋与吡格列酮可显著下调模型动物肝脏和肝细胞miR-34a与miR-29b表达水平。进一步使用miR-29b或miR-34a inhibitor或mimic转染分别验证miR-29b与insig-1、miR-34a与Sirtl可能存在的靶向关系。与阴性转染合并高果糖刺激肝细胞比较,miR-29b inhibitor与miR-34a inhibitor分别上调高果糖刺激肝细胞insig-1与Sirtl蛋白水平,下调SREBP-1c蛋白水平,同时提高IRS2和p-Akt磷酸化蛋白水平(BRL-3A:12h; HepG2:12h),降低FAS蛋白水平并增加ABCA1蛋白水平,减轻脂质沉积(BRL-3A:24h; HepG2:12h).在miR-29b或miR-34a inhibitor转染高果糖刺激肝细胞中,与阴性对照转染合并高果糖刺激肝细胞比较,紫檀茋与吡格列酮亦可抑制高果糖所导致的insig-1或Sirtl低表达,下调SREBP-lc蛋白水平,上调IRS2和p-Akt磷酸化蛋白水平(BRL-3A:12 h; HepG2:8h),降低FAS蛋白水平并增加ABCA1蛋白水平,减轻脂质沉积(BRL-3A:24 h; HepG2:12h)。与阴性对照转染合并高果糖刺激肝细胞比较,miR-29b和miR-34a mimic分别进一步下调高果糖刺激肝细胞中insig-1与Sirtl蛋白水平,上调SREBP-1c蛋白水平,下调IRS2和p-Akt磷酸化蛋白水平(BRL-3A:12h;HepG2:8h),升高FAS蛋白水平并降低ABCA1蛋白水平,加重脂质沉积(BRL-3A: 24 h; HepG2:12 h)。在miR-29b或miR-34a mimic转染高果糖刺激肝细胞中,与阴性对照转染合并高果糖刺激细胞比较,miR-29b或miR-34a mimic分别部分地抑制紫檀茋与吡格列酮对insig-1或Sirtl蛋白表达的上调作用,并部分地抑制其对SREBP-1c高表达、IRS2和p-Akt低表达(BRL-3A:12h; HepG2:8h)、FAS高表达和ABCA1低表达,及对脂质沉积的改善作用(BRL-3A:24h;HepG2:12h)。这些研究结果提示,高果糖可能通过上调miR-29b和miR-34a表达而下调肝脏insig-1和Sirtl表达使SREBP-1c相关胰岛素信号通路受损、脂合成与转运相关蛋白表达异常,从而造成肝脏脂质沉积。紫檀茋可能通过下调模型动物肝脏和肝细胞miR-29b与miR-34a表达而上调insig-1和Sirtl表达,改善SREBP-lc相关的胰岛素信号通路损伤,调节脂质合成与转运相关蛋白,从而减轻脂质沉积。本文另一研究重点是探寻高果糖是否提高H2O2水平而下调miR-200a表达以影响肝脏TXNIP表达,激活NHLRP3炎症小体,产生IL-1β,从而造成肝脏炎症反应?以及姜黄素的逆转作用及其分子作用机制。与正常组比较,高果糖模型大鼠肝脏组织呈现明显的炎性细胞浸润,肝脏TXNIP、NLRP3、ASC、半胱氨酸天冬氨酸酶-1(caspase-1)和IL-1p蛋白高表达。体外高果糖(5mM)处理BRL-3A与HepG2模型也观察到TXNIP、NLRP3、ASC、 caspase-1和IL-1p蛋白水平显著升高(BRL-3A:12h; HepG2:48h)。这些研究结果提示,高果糖可诱导大鼠肝脏与肝细胞TXNIP高表达、NLRP3炎症小体的激活与IL-1p产生,促进炎症反应的发生。与模型对照组比较,姜黄素与别嘌呤醇均可下调模型动物和细胞TXNIP、NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1p蛋白水平,减轻炎症反应。经niRNAs基因芯片分析发现高果糖模型大鼠肝脏miR-200表达水平显著低于正常组,这一结果也被qPCR验证。与正常细胞组比较,高果糖可下调肝细胞miR-200a表达水平(BRL-3A:4h; HepG2:8h)。与果糖模型动物与细胞对照组比较,姜黄素与别嘌呤醇可显著上调高果糖模型动物肝脏及肝细胞miR-200a表达水平。进一步使用miR-200a mimic或inhibitor转染以验证miR-200a与TXNIP可能存在的靶向关系。与阴性转染合并高果糖刺激组比较,miR-200a mimic下调肝细胞模型TXNIP、NLRP3、ASC、caspase-1与IL-1p蛋白水平(BRL-3A:12h;HepG2:48 h)。与阴性转染合并高果糖刺激组比较,miR-200a inhibitor则进一步促进高果糖所诱导的肝细胞TXNIP蛋白高表达,同时也进一步上调NLRP3、ASC、caspase1与IL-1β蛋白水平,从而加重肝细胞炎症反应(BRL-3A:12h; HepG2:48h)。提示高果糖所诱导miR-200a低表达可能介导了TXNEP/NLRP3炎症小体的激活,从而促进IL-1β产生诱导肝细胞炎症反应的发生。在miR-200a mimic转染肝细胞上,与阴性转染合并高果糖刺激组比较,姜黄素与别嘌呤醇下调TXNIP、NLRP3、ASC、 caspase-1与IL-1β蛋白水平(BRL-3A:12h; HepG2:48h)。在miR-200a inhibitor转染高果糖刺激肝细胞上,与miR-200a inhibitor转染高果糖刺激组比较,miR-200a inhibitor干扰姜黄素与别嘌呤醇对TXNIP/NLRP3炎症小体的激活与IL-1β产生的抑制作用(BRL-3A:12h; HepG2:48h)。这些研究结果提示,姜黄素与别嘌呤醇对高果糖所诱导的肝细胞TXNIP/NLRP3炎症小体激活的抑制作用可能部分依赖于miR-200a表达的上调。上述研究结果表明,高果糖所引起动物肝脏和肝细胞miR-200a低表达可能增加TXNIP表达,激活NLRP3炎症小体促进IL-1β产生而诱导肝脏炎症；姜黄素与别嘌呤醇可能通过上调模型动物肝脏和肝细胞miR-200a表达,降低TXNIP和NLRP3炎症小体的激活和减少IL-1β产生从而减轻肝脏炎症。与正常组比较,高果糖模型大鼠肝脏H202、以及超氧化物阴离子(O2·-)和总ROS水平显著升高；超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性和谷胱甘肽(GSH)水平下降,并在体外肝细胞模型上获得证实,即H2O2、ROS和02-水平显著升高、CAT活性降低(BRL-3A:4h; HepG2:8h),进一步证实高果糖可诱导大鼠肝脏与肝细胞氧化应激的发生。与模型对照组比较,姜黄素与别嘌呤醇可显著降低模型动物肝脏H2O2、O2-及总ROS水平,并显著上调SOD、CAT活性与GSH水平；也可显著降低肝细胞模型总ROS、H2O2和O2-水平并上调CAT活性(BRL-3A:4h; HepG2:8h)。这些研究结果表明姜黄素与别嘌呤醇可抑制这些动物与细胞氧化应激。与高果糖刺激肝细胞比较,CAT抑制剂3-氨基-1,2,4-三氮唑(ATA)可加重高果糖刺激肝细胞CAT低活性与高H202水平(BRL-3A:4h; HepG2:8h),进一步上调TXNIP蛋白水平,促进高果糖所导致肝细胞NLRP3炎症小体的激活与IL-1β产生(BRL-3A:12h; HepG2:48h)。与高果糖刺激肝细胞比较,ATA部分地抑制姜黄素与别嘌呤醇对高果糖所诱导的肝细胞低CAT活性、高H2O2 (BRL-3A: 4h; HepG2:8h)、高TXNIP水平,NLRP3炎症小体激活与IL-1β产生(BRL-3A: 12h; HepG2:48h)的逆转作用。这些结果提示,高果糖摄入所引起高水平H2O2可能增加TXNIP蛋白水平并激活NLRP3炎症小体和IL-1p产生从而诱导肝细胞炎症。姜黄素与别嘌呤醇可抑制高果糖所诱导TXNIP/NLRP3炎症小体的激活,减少IL-1p从而减轻肝细胞炎症反应,可能是与其抗氧化活性及清除H202有关。此外,H2O2 (50 μM)可下调肝细胞miR-200袁达水平(BRL-3A:4h; HepG2:4h),这一效应可被姜黄素与别嘌呤醇所逆转。本文小结：高果糖可能通过上调肝脏miR-29b与miR-34a表达而下调insig-1和Sirtl蛋白水平,使SREBP-1c相关胰岛素信号通路受损、脂合成与转运相关蛋白表达异常,从而造成肝脏脂质沉积；高果糖所引起高水平H202可能下调miR-200a表达而增加TXNIP蛋白水平和NLRP3炎症小体的激活,产生IL-1β而诱导肝脏炎症。紫檀茋可能通过下调miR-29b与niR-34a表达而上调insig-1和Sirtl蛋白水平,改善SREBP-1c相关胰岛素信号通路,调节脂质合成与转运相关蛋白,从而减轻模型动物肝脏和肝细胞脂质沉积。姜黄素则可能通过上调miR-200a表达以降低TXNIP并抑制NLRP3炎症小体的激活和IL-1β产生从而改善肝脏炎症,这一过程可能与其抗氧化效应有关。这些研究结果说明高果糖摄入引发肝脏胰岛素敏感性降低、氧化应激、炎症反应与脂质沉积新途径,并揭示紫檀茋、姜黄素肝保护新的分子作用机制,为其临床防治代谢综合征及其相关肝损伤等提供了实验基础。