论文部分内容阅读
人参皂苷是人参的主要活性成分,能够保护细胞内源性系统对抗氧化损伤,普遍认为人参抑制氧化应激的功能主要归功于人参皂苷。本论文以人参皂苷为研究对象,以皂苷得率为指标、以抑制氧化应激活性为功能诉求,以期得到具有高产率、高活性的人参皂苷的提取方法,旨在寻求高活性人参皂苷的基础上通过HEK-293氧化应激损伤模型考察人参皂苷的氧化应激抑制活性,并研究其对细胞氧化损伤的协同干预作用,探讨人参皂苷协同抑制氧化应激的机制。首先,采用高压脉冲电场(PEF)技术提取人参皂苷,通过单因素和响应面试验优化了人参皂苷的最佳提取工艺,即电场强度60 k V/cm,脉冲时间为10μs,料液比为1:110,在此条件下,人参皂苷的最大得率为0.981%±0.012%;以得率为指标比较PEF与其它提取方法的提取效果,发现其得率高于冷浸法(SCSE)、热回流提取法(HRE)、超声波辅助提取法(UAE)、微波辅助提取法(MAE);采用DPPH清除活性和氧自由基吸收能力(ORAC)为指标考察了PEF和SCSE提取的人参皂苷的抗氧化活性,表明PEF提取可以增加人参皂苷的DPPH清除能力和ORAC能力;建立H2O2诱导的HEK-293细胞氧化应激损伤模型,确定400μM为最佳损伤浓度;通过考察PEF和SCSE提取的人参皂苷对HEK-293细胞的保护作用、对ROS的抑制作用,并利用扫描电镜观察细胞表面形态变化,表明PEF提取能提高人参皂苷对抗细胞氧化应激损伤能力,并且这种保护作用不是通过促进细胞增殖实现的;通过细胞抗氧化活性试验(CAA)发现SCSE提取的人参皂苷其EC50值(150.03±4.03μg/m L)是PEF(60.22±2.69μg/m L)的2.5倍,PEF组的CAA值高于SCSE组,表明PEF技术可以提高人参皂苷的细胞抗氧化活性。其次,通过DPPH清除试验从14种人参皂苷中筛选出活性最强的是F1,其次是F2和Rh2,且多数原人参二醇型的自由基清除能力稍强于原人参三醇型,但与Trolox(25μM)相比,人参皂苷的DPPH清除能力较弱;ORAC评价方法筛选出活性最强的是Rb3,其次是F1和一些常见皂苷Rb1、Rg1、Rg2、Rb2,Rg3和Ro的活性最弱,一些常见皂苷变成次级皂苷后活性增强,表明人参皂苷降解程度的不同或构型的不同导致其ORAC活性差异较大;结合H2O2诱导的HEK-293细胞氧化应激模型,筛选细胞保护能力最强的是F2,其次是Rb1和Rg1,细胞活力分别比损伤组高28%、21%和18%;通过考察F2与蛋清源抗氧化肽WNWAD和WLKFI、水溶性维生素E(Trolox)以及矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(C3G)对氧化损伤细胞的联合保护作用,得到具有协同作用的是F2与C3G。进一步验证F2与C3G协同抑制氧化应激作用并研究其作用机制,采用H2O2诱导的HEK-293细胞氧化损伤模型,通过DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS含量,表明F2与C3G能协同抑制ROS的产生与积累从而保护HEK-293细胞对抗H2O2诱导的氧化应激;通过考察细胞MDA水平和抗氧化酶系活性,发现F2与C3G能协同降低细胞MDA水平、提高SOD、GSH-Px和CAT的活性,表明协同干预能明显减轻细胞脂质过氧化损伤,加强抗氧化酶防御系统;通过Western blot和RT-PCR技术考察协同干预对氧化应激相关的关键转录因子Nrf2及其结合蛋白Keap1的蛋白和m RNA表达量的影响,表明F2与C3G能协同抑制由H2O2诱导的HEK-293细胞氧化应激损伤,其部分作用机制是调节Nrf2/Keap1信号通路及其固有的抗氧化活性。最后,进一步研究F2与C3G协同干预对H2O2诱导HEK-293细胞氧化应激介导的细胞凋亡的抑制作用及机制,通过考察F2与C3G协同对细胞内LDH释放和线粒体膜电位(MMP)变化的影响,发现F2与C3G均能显著抑制H2O2诱导的LDH释放和线粒体膜电位下降,并表现出协同增效作用,表明二者能协同抑制H2O2引起HEK-293细胞早期凋亡;考察Caspase-6和Caspase-9的活性研究表明F2与C3G能协同干预Caspase-6和Caspase-9蛋白酶的活化从而抑制H2O2诱导细胞凋亡;利用Western blot检测了Bcl-2凋亡家族、Caspase凋亡家族相关凋亡蛋白的表达量变化,结果表明F2和C3G能显著抑制H2O2引起的抑凋蛋白Bcl-2的降低,提高促凋蛋白Bax、Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP表达的升高,二者能通过协同抑制线粒体介导的凋亡通路,从而抑制由H2O2诱导的细胞凋亡;最后采用Western blot和q RT-PCR技术测定了NF-κB p65的蛋白和m RNA表达变化,结果表明F2和C3G能通过抑制p65磷酸化从而抑制NF-κB通路激活,它们能协同抑制NF-κB通路介导的细胞凋亡。综上,本文研究结果表明,人参皂苷能协同干预HEK-293细胞氧化应激,通过靶向氧化应激和细胞凋亡相关信号通路发挥协同抑制氧化应激作用,为人参在食品领域的应用提供一定理论基础。