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柑橘木虱（Diaphorina citri）是许多柑橘产区新稍期主要害虫之一,以刺吸式口器取食柑橘汁液,主要为害柑橘嫩稍,严重时致嫩梢枯萎和畸形。此外,柑橘木虱还可以分泌大量白色蜜露,黏附于叶片上,易诱发煤烟病,影响叶片光合作用,造成树势衰弱。更严重的是,柑橘木虱是柑橘黄龙病菌（Citrus Huanglongbing）的重要传播媒介。因此,柑橘木虱的防治对柑橘黄龙病的防控具有重要意义。目前,化学防治仍然是柑橘木虱防控中的主要手段。虽然化学防治能迅速降低木虱的种群数量,但极易造成农药残留、环境污染、害虫抗药性等问题。而生物防治具有巨大的发展潜力。渐狭蜡蚧菌（Lecanicillium attenuatum）作为一种重要的生防真菌,对木虱等半翅目害虫具有较强的侵染力。渐狭蜡蚧菌可借助菌丝穿透昆虫体壁,破坏昆虫的正常生命活动,参与营养竞争,并最终致昆虫死亡。本文探究了渐狭蜡蚧菌对柑橘木虱的致死率和毒力,并利用分子改造手段,成功构建了柑橘木虱卵黄蛋白原基因的RNAi载体,并将其导入渐狭蜡蚧菌基因组中,进一步对转基因菌株进行了评价,为渐狭蜡蚧菌遗传改造提供新的方法。研究结果如下:1.渐狭蜡蚧菌对柑橘木虱的侵染效果利用渐狭蜡蚧菌菌株TN002不同浓度孢子悬浮液,分别采用浸没法和套袋喷洒法处理成虫、卵及1-5龄若虫,统计其死亡率,评价该菌株对柑橘木虱的侵染效果。结果发现,用浓度梯度孢子悬浮液浸没处理成虫10 d后,LC50为3.08×105孢子/m L。用3.0×108孢子/m L孢子悬浮液套袋喷洒处理卵和1-5龄若虫7 d后,卵和1龄若虫的矫正死亡率分别为20.39%和48.38%,2-5龄若虫死亡率随龄期的增加显著递减（P<0.05）。结果表明,渐狭蜡蚧菌对各龄期柑橘木虱均有一定的侵染能力,但毒力较低,因此,有必要对其进行改造,提高菌株侵染木虱的速度,从而获得高毒力菌株。2.丝状真菌表达载体的构建与改造为更加直观评价载体在转基因菌株中的表达情况,根据同源重组原理,选择一步克隆法将PtrpC启动子+EGFP基因片段连接到丝状真菌表达载体pRCy1中,获得有报告基因EGFP的丝状真菌表达载体,命名为pRCy3。对柑橘木虱转录组数据库进行筛选分析,选择柑橘木虱卵黄蛋白原基因的2个保守域作为目的序列,标记为DcVg1a和DcVg1b。根据同源重组原理,用一步克隆法分别将目的基因的正/反向片段转入pRCy3载体启动子和intron之间,并对其进行菌液PCR、酶切和测序验证,获得含有PtrpC启动子+正向目的片段+intron+反向目的片段+TtrpC终止子结构的丝状真菌表达载体,完成ihpRNA表达盒的构建。3.农杆菌介导的ihpRNA表达盒转化渐狭蜡蚧菌利用冻融法,将构建成功的ihpRNA表达盒进行转化,利用培养基筛选、引物扩增和酶切的方法对农杆菌菌株AGL1阳性克隆进行验证,获得含有ihpRNA表达盒的农杆菌菌株。进一步利用乙酰丁香酮诱导培养法,将农杆菌诱导培养6 h后与渐狭蜡蚧菌孢子悬浮液共培养60 h,将其共同转移到潮霉素选择性培养基上继续培养后分离纯化,用菌液PCR、酶切和荧光实时观察方法检测,结果表明,柑橘木虱卵黄蛋白原基因ihpRNA表达盒已整合进入渐狭蜡蚧菌基因组内,渐狭蜡蚧菌菌株的遗传改造完成。4.转基因菌株的效果评价在完成对渐狭蜡蚧菌的遗传改造基础上,分别从生物学特性、遗传稳定性、毒力和基因表达水平评价了转基因菌株。在生物学特性方面,转基因菌株La::DcVg1a和La::DcVg1b的生长速率和单位产孢量,均与野生型菌株无显著性差异,说明柑橘木虱卵黄蛋白原基因的转入对渐狭蜡蚧菌生物学特性无显著影响。在遗传稳定性方面,转基因菌株在无抗生素的PDA培养基上连续培养10代后仍能用潮霉素检测引物扩增出阳性条带,说明农杆菌介导转化法具有很好的稳定性。在毒力评价中,用浸没法处理柑橘木虱成虫10 d后,通过计算LC50值和LT50值评估菌株对柑橘木虱成虫的毒力。发现La::DcVg1a和La::DcVg1b菌株的LT50分别为4.67 d和4.33 d,显著短于野生型菌株（P<0.05）;La::DcVg1a和La::DcVg1b菌株的LC50分别为1.10×104和5.60×104孢子/mL,均显著低于野生株和La::EGFP（P<0.05）,与野生株相比,La::DcVg1a和La::DcVg1b毒力分别提高了28.00和5.50倍,结果表明,转基因渐狭蜡蚧菌La::DcVg1a和La::DcVg1b对柑橘木虱的毒力显著提高。在基因表达水平评价中,用转基因渐狭蜡蚧菌孢子悬浮液浸没处理柑橘木虱雌成虫15 s,随后,每24 h收集一次雌成虫,进行荧光实时定量PCR,以0.05%吐温-80溶液处理作对照,与La::EGFP菌株相比,转基因菌株La::DcVg1a和La::DcVg1b表达量在4-6 d时显著降低（P<0.05）。说明转基因菌株在侵染过程中确有siRNA的释放。本研究为利用病原真菌防治柑橘木虱提供了新的思路。