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目的:抑癌基因p53促凋亡活性丧失是肿瘤形成的主要因素之一。肝癌中约30～40%存在p53基因突变,而肝癌细胞野生型p53基因的功能丧失则可能与ASPP基因家族调控失常有关。ASPP(apoptosis stimulatingprotein of p53,ASPP)基因家族中ASPP1、ASPP2能选择性增强p53的促细胞凋亡功能。本实验研究肝癌细胞中ASPP1、ASPP2基因的异常表达及启动子区甲基化调控机制,并以临床组织标本佐证,以期探讨原发性肝癌形成中ASPP1、ASPP2表达异常的分子机制,寻求肝癌早期防治分子靶点。方法:1.利用RT-PCR方法检测ASPP1、ASPP2在7种肝癌细胞中表达水平,利用MSP-PCR方法检测ASPP1、ASPP2基因启动子甲基化状况;以肝癌细胞Huh7为细胞模型,观察甲基转移酶抑制剂(5’-aza-2’CdR)和(或)组蛋白去乙酰化酶抑制剂(TSA)对ASPP1、ASPP2基因启动子区甲基化与mRNA表达的影响。分析肝细胞中ASPP1、ASPP2基因启动子区甲基化状态与mRNA表达异常的相互关系。2.MSP-PCR法检测52例肝癌及癌旁组织ASPP1、ASPP2基因启动子甲基化状况,免疫组化法检测其中41例肝癌组织标本p53基因突变蛋白,分析ASPP1、ASPP2基因启动子甲基化状况。p53突变和临床指标的关系。结果:1.RT-PCR法检测结果显示ASPP1、ASPP2基因mRNA在各个肝癌细胞中都有表达,但表达量各不相同,肝癌细胞Huh7表达量最弱,肝癌细胞HepG2表达量相对较强,但所有肝癌细胞ASPP1、ASPP2基因mRNA表达量均小于肝细胞HL7702。2.MSP-PCR法检测结果显示ASPP1、ASPP2基因启动子区甲基化引物在大部分肝癌细胞中能扩增出阳性条带,但肝癌细胞HepG2和肝细胞HL-7702无阳性条带;非甲基化引物除了肝癌细胞Huh7在其他细胞株中均能扩增出阳性条带。肝癌细胞HepG2和肝细胞HL-7702表现为ASPP1、ASPP2基因启动子非甲基化状态;肝癌细胞Huh7表现为完全甲基化状态;其余肝癌细胞则表现为半甲基化状态。3.甲基转移酶抑制剂(5’-aza-2’CdR)和(或)组蛋白去乙酰化酶抑制剂(TSA)能逆转ASPP1、ASPP2基因启动子区甲基化并上调mRNA表达,两者呈现剂量依赖关系并有协同作用。4.MSP-PCR检测52例肝癌组织中ASPP1基因启动子区甲基化病例有21.1%(11/52),ASPP2基因甲基化病例有34.6%(18/52),两个基因均甲基化病例有5.7%(3/52),两个基因中有一个存在甲基化病例占50%(26/52);癌旁组织中ASPP1基因启动子区甲基化病例占15.3%(8/52),ASPP2基因甲基化病例占23%(12/52),两个基因均甲基化病例有5.7%(3/52),两个基因中有一个存在甲基化病例占32.6%(17/52)。免疫组化显示肝癌组织中p53蛋白染色阳性(p53基因突变)为34.1%例(14/41),癌旁组织p53蛋白染色阴性;临床肝癌组织ASPP1、ASPP2基因启动子区甲基化与p53蛋白染色阳性负相关(p=0.042);癌旁组织中ASPP1、ASPP2基因启动子区甲基化与肿瘤大小(p=0.022),临床分期(p=0.046)负相关。结论:1.肝癌细胞ASPP1、ASPP2基因启动子区高度甲基化状态导致mRNA表达下调。2.肝癌及癌旁组织ASPP1、ASPP2基因启动子区甲基化状态与p53蛋白染色阳性,肿瘤大小,临床分期负相关,提示了ASPP1、ASPP2表达异常可能参与肝癌形成。