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目的:中医认为脾藏意主思,脾运化水谷和升清的作用使脑髓得充,从而发挥思维记忆的功能。若脾气不足气血生化乏源,则会导致神失所养,表现出注意力不集中,学习记忆能力下降等症状,临床证明中医健脾益气升阳的治疗方法可以改善上述症状。然而,脾气虚导致认知能力下降的内在病理机制尚不明确,补益中气通过作用于何种病理环节或分子靶点改善认知症状仍缺乏深入认识。现代医学研究表明海马是整合内脏功能与情绪、思维和学习记忆的重要部位,能量供给不足将引起其功能紊乱,而线粒体作为为生命活动提供能量的重要细胞器,对海马的生理功能具有重要作用。脾气虚脑髓失养,可导致海马神经细胞需氧代谢下降,自由基生成增加,造成线粒体的氧化损伤,影响线粒体的氧化磷酸化功能,最终引起海马功能异常,这可能是脾气虚证患者认知能力下降的分子机制之一。因此,本研究以脾气虚证模型大鼠为研究对象,以补脾益气的代表性方剂补中益气汤为干预手段,从海马神经元线粒体氧化损伤角度深入探究脾气虚证导致认知能力下降的病理实质,并揭示补中益气汤改善认知能力的分子机制。同时,为了评价益气升阳药在改善大脑认知功能中的作用,本实验将补中益气汤进行了拆方研究。方法:1.首先采用利血平皮下注射的方式建立脾气虚证大鼠模型。2.观察补中益气汤及其拆方对脾气虚证大鼠学习记忆能力的影响:将SD大鼠随机分为6组,即正常组、模型组、达纳康组(阳性药)、拆方1组、拆方2组、补中益气汤组,通过脾气虚证动物模型症状量化积分表、血清D-木糖含量对各组大鼠的脾气虚症状进行评价,通过旷场实验、水迷宫实验、穿梭实验对大鼠自主活动及学习记忆能力进行检测。3.观察补中益气汤及其拆方对脾气虚证大鼠脑海马线粒体结构及功能的影响:动物分组及处理同上,通过HE染色及透射电镜观察各组大鼠海马形态结构及神经元内线粒体超微结构的改变;利用生化检测试剂盒检测线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ-Ⅳ活性,通过化学发光法检测海马区ATP含量判断线粒体功能的变化。4.观察补中益气汤及其拆方对SIRT3/MnSOD/OGG1通路及mtDNA氧化损伤的影响:动物分组及处理同上,提取大鼠海马组织内线粒体,通过western blot的方法,观察SIRT3、MnSOD,OGG1的水平,并通过检测线粒体mtDNA上8-OH-dG的含量评价海马区线粒体DNA氧化损伤的程度,探明补中益气汤及其拆方是否作用于SIRT3/MnSOD/OGG1通路发挥改善线粒体氧化损伤的作用。结果:1.补中益气汤可显著改善模型大鼠的脾气虚症状,提高学习记忆能力:症状积分量表结果显示,与正常组相比,模型组大鼠体重增加明显趋缓(P<0.01),症状总评分及单项评分均升高(P<0.05,P<0.01,P<0.001),血清D-木糖含量降低(P<0.001),与模型组比较,给药组大鼠体重增加明显,症状积分总分及单项积分均明显下降,血清D-木糖含量均升高(P<0.05,P<0.001),其中补中益气汤组作用最为明显(P<0.05,P<0.01,P<0.001),拆方1组作用优于拆方2组;旷场实验、Morris水迷宫及穿梭实验显示,模型组大鼠较正常组自主活动能力、空间定位记忆能力及主动和被动学习能力均明显下降(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。治疗给药后大鼠各项指标均较模型组明显改善(P<0.05,P<0.01,P<0.001),其中补中益气汤组的旷场实验多项指标优于达纳康药及拆方2组(P<0.05,P<0.001),活动距离、平均速度两项指标优于拆方1组(P<0.05,P<0.001);水迷宫实验中,补中益气汤组多项指标均优于两拆方组(P<0.05,P<0.01,P<0.001);在穿梭实验中,补中益气汤组出现主动逃避的行为,其余各项指标也均较模型组有所改善。2.补中益气汤可显著改善脾气虚证大鼠海马组织形态异常:HE染色结果显示,造模后大鼠海马锥体细胞排列疏松不整齐,间隙明显,空泡增多,细胞核明显固缩深染。补中益气汤组及两拆方组海马锥体细胞均较模型组有所改善,细胞层次增多、胞质空洞减轻,补中益气汤组效果最为明显。3.补中益气汤可有效改善脾气虚证大鼠海马线粒体的结构和功能异常:电镜结果表明模型组大鼠海马区线粒体形态出现明显异常,出现肿胀或皱缩,数量少,结构异常,出现严重的嵴断裂或膜破裂,并伴有严重的空泡化现象;治疗后各组线粒体均有所好转,嵴断裂及空泡化现象减少,线粒体数量有所上升,其中补中益气汤组治疗效果最佳,其次为拆方1组、拆方2组。四种线粒体复合物的检测结果显示,模型组大鼠线粒体复合物Ⅰ-Ⅳ活性下降,与正常组比较有显著差异(P<0.05,P<0.001);与模型组比较,各治疗组四种线粒体复合物的活性均有不同程度的升高,其中补中益气汤全方组的四种线粒体复合物活性明显升高(P<0.05,P<0.01,P<0.001),而两拆方组与模型组比较,只有拆方1组的复合物Ⅳ的上升变化具有统计学意义(P<0.01);三个中药组比较可以发现,补中益气汤组的四种复合物较拆方2组均明显升高(P<0.05,P<0.01,P<0.001),而两拆方组无显著差异,体现出配伍的优势。造模后各模型组大鼠线粒体ATP含量下降,与正常组比较差异具有显著性(P<0.05);与模型组比较,各治疗组线粒体ATP含量均升高(P<0.01,P<0.001),但各拆方组与全方组之间没有差异。4.补中益气汤可通过调节SIRT3/MnSOD/OGG1通路,减轻mtDNA的氧化损伤:Western Blot结果显示,与正常组相比,模型组的SIRT3蛋白明显下降(P<0.05),与模型组相比,各治疗组SIRT3蛋白的含量均有明显增高(P<0.01,P<0.001),提示各治疗组均有不同程度的提高线粒体内SIRT3蛋白含量的作用,作用从高到低依次为补中益气汤组>拆方1组>拆方2组>达纳康组;分析MnSOD蛋白乙酰化情况可知,正常情况下,MnSOD蛋白乙酰化程度很低,但在造模之后,乙酰化的MnSOD蛋白含量明显上升(P<0.001),补中益气汤可有效降低MnSOD蛋白乙酰化的水平,效果优于达纳康及拆方1组,组间差异具有统计学意义(P<0.05);线粒体内OGG1蛋白的表达情况显示,与正常组相比,模型组的OGG1蛋白有轻微降低(P<0.01),与模型组相比,各治疗组OGG1蛋白的含量均有明显增高(P<0.01,P<0.001),提示补中益气汤及其拆方均有不同程度的提高线粒体内OGG1蛋白含量的作用,其中补中益气汤组效果优于拆方2组(P<0.01),但是与拆方1组差异不明显;对8-OH-dG含量测定结果表明:造模后各实验组大鼠线粒体DNA中8-OH-dG含量明显升高,与正常组比较差异具有显著(P<0.001);与模型组比较,治疗组中补中益气汤组与拆方1组大鼠线粒体DNA中8-OH-dG的含量均下降明显(P<0.05,P<0.01),其余两组较模型组差异不明显,拆方组中拆方1组的8-OH-dG含量较全方组偏低并具有明显差异(P<0.01)。结论:1.利血平所致脾气虚证模型大鼠出现了明显认知能力下降,机制研究显示其大脑海马区形态学发生改变,线粒体超微结构和功能出现异常,线粒体发生氧化应激损伤。所以脾气虚状态下海马线粒体氧化损伤进而导致线粒体及海马区域形态及功能异常,可能是脾气虚证出现学习记忆能力下降的内在病理机制。2.补中益气汤能够通过上调去乙酰化蛋白SIRT3的表达,减少MnSOD乙酰化程度,并增加OGG1的表达,从而改善线粒体氧化损伤的状态,这可能是该复方提高脾气虚证患者认知能力的内在机制之一。3.经过对补中益气汤的拆方研究发现,拆方1组在对脾气虚证大鼠认知能力改善以及脑海马线粒体功能的保护作用优于拆方2组,提示合理配伍益气升阳药物在治疗因“脾不升清”导致学习记忆功能下降中具有重要意义。