棉花盐胁迫应答基因GhSR13的克隆和功能分析

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随着土地环境不断恶化,盐碱地面积不断扩大,如何有效利用这些盐碱地,成为摆在我们面前的现实问题。棉花具有很高的耐盐性和耐旱性,可是在实际的生产过程中,可利用的耐盐耐旱品种并不多见,这就需要通过基因工程手段或者分子生物学手段,寻找出一些耐盐基因,然后运用基因工程技术,培育出优良的棉花品种。  前期利用基因芯片测序技术,得到一条EST序列信息,通过NCBI数据库比对分析,陆地棉数据库公布的基因信息,成功克隆了该基因的CDS全长序列,并命名为GhSR13。该基因CDS全长1476 bp,编码492个氨基酸。随后进行有关GhSR13序列生物信息学的分析。首先,对GhSR13的蛋白家族进行分析发现,该基因属于DDE_Tnp_1_6家族。随后结合NCBI数据库,以及最近公布的二倍体和四倍体棉花4数据库,做了棉花同源种属的同源性分析和不同种属的同源性分析,并对该EST序列的开放阅读框以及保守结构域进行了预测分析。通过同源性比对,在番茄以及拟南芥中都发现了与GhSR13同源的基因,同源性达到了50%以上,在番茄中该同源基因已经被证明参与盐胁迫反应途径,而在拟南芥中,该同源基因也被证明响应盐胁迫途径。在得到了该基因的CDS序列后,开展了以下实验。  首先对该基因是否响应盐胁迫作了定量分析,在用200 mM NaCl处理后,在0 h,1 h,4 h,6 h,12 h,24 h,分别提取棉花的真叶和根的RNA反转录为cDNA后进行定量分析。结果表明,在根中,GhSR13的表达量发生了明显的变化,推测测其可能参与了盐胁迫反应途径。  随后,构建了GhSR13-GFP和GhSR13-GUS等一系列的载体,进一步研究该基因是否响应盐胁迫。GFP荧光亚细胞定位结果表明,GhSR13蛋白定位于细胞核。GUS染色结果表明,该基因主要在根成熟区表达。通过构建表达有GhSR13-PYES2的酵母菌株并进行盐处理发现,在200 mM NaCl,10 mM LiCl处理条件下,含有目的基因的酵母菌落生长状况均不如空白对照,进一步表明该基因是参与了盐胁迫反应途径。在随后的VIGS实验中发现,600 mM NaCl处理后的棉花叶片发生明显的萎蔫,而且被干涉掉的基因棉花植株萎蔫程度要比对照高,表明在基因干涉掉后,加剧植物对盐胁迫途径的调控反应,造成植株对盐的耐受性降低。通过将棉花基因转入拟南芥材料获得转基因植株,选取了3个株系(OE-2,OE-3,OE-4)进行盐处理的表型实验,结果表明,(OE-2,OE-3, OE-4)这三个转基因种子在萌发上对盐的敏感性明显要比野生型高,根伸长也表现出对盐更高的敏感性。以上结果均表明GhSR13基因参与棉花盐胁迫响应调节。
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