研究背景:妊娠期高血压疾病(hypertensive disorder complicating pregnancy)是以高血压、水肿和蛋白尿为特征的产科常见并发症,是孕产妇及围产儿死亡的重要原因。由于其发病机理尚未完全阐明,所以就给该病的防治带来了一定困难。从胚胎植入到胎儿分娩,成功的妊娠依赖于正常的胎盘功能。滋养层细胞对子宫内膜侵入过浅,子宫螺旋动脉重塑障碍是妊娠期高血压疾病胎盘的病理特点。滋养层细胞浅植入,子宫螺旋动脉重塑不全,胎盘供血受影响,缺血缺氧,致使滋养层细胞释放一系列的毒性因子进入母体血液循环,引起广泛的血管内皮细胞损伤,最终导致妊娠期高血压疾病的发生[1]。目前国内外已有大量研究证明妊娠早期氧分压变化与滋养细胞侵入能力的变化密切相关。在胎盘形成过程中,滋养层细胞的侵润能力决定妊娠的结局,而滋养层细胞的侵润能力则与胎盘局部氧含量密切相关,长时间的缺氧环境使滋养细胞的增殖活动增强,但是却影响滋养细胞对子宫内膜的侵入。因此,在妊娠期高血压疾病的发病过称中低氧应答发挥着重要作用。缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor 1,HIF-1)是目前为止发现的唯一在缺氧状态下发挥特异活性的转录调节因子。它属于缺氧反应基因的中介因子,可以传导缺氧信号,激活一些与缺氧相关联的基因,如胰岛素样生长因子、基质金属蛋白酶类、内皮素类、生长转化因子、一氧化氮合酶等,参与调节滋养细胞增值分化,影响子宫螺旋动脉的新生或重塑,使细胞能够适应低浓度氧环境。同样,若其表达异常也可引起多种病理变化。其下游调控因子ET-1是迄今为止我们发现的影响血管收缩能力最强的生物物质,它具有广泛的生物学活性,,对于平滑肌收缩、钙离子运转、神经信号传导、多种细胞的凋亡等方面都具有调节功能。基质金属蛋白酶9( matrix metalloproteinases-9,MMP-9)是基质金属蛋白酶系统的重要成员之一,与某些生理功能(如胚胎的植入、组织发生、伤口愈合等)和病理过程(肿瘤的侵润和转移)密切相关。胚胎侵入母体需要黏附、降解、穿越ECM间隙而完成。MMP-9直接作用于血管腔面附着物、蜕膜间质及基底膜,发挥着酶降解功能,为滋养细胞浸润子宫内膜清除了障碍,是滋养细胞浸入活动的限速步骤,也是经过大量体内外实验得到公认的机制[2]。但MMP-9的表达是否与孕早期胎盘形成时低氧应答过程中HIF-1α表达异常有关,两者是否存在相关性目前鲜有报道给予说明。本实验旨在通过研究氧调节因子HIF-1α与其下游调控因子ET-1及MMP-9的相互关系,探讨低氧应答异常对于妊娠期高血压疾病胎盘植入及子宫螺旋动脉重塑的影响,为妊娠期高血压疾病的病因病机研究提供新的思路和证据。实验目的及意义:1.通过临床标本收集检测氧调节因子HIF-1α与其下游调控因子ET-1在子痫前期患者及正常妊娠患者胎盘中的表达,说明两者的相关性,为HIF-1α及ET-1在妊娠期高血压疾病发病过称中的作用提供理论依据。2.通过分离培养早孕期绒毛滋养细胞,探索绒毛组织滋养层细胞简单有效的培养方法,为体外研究滋养细胞疾病提供有效的物质基础。3.通过检测不同氧浓度下体外培养的滋养细胞HIF-1α和MMP-9的表达量,说明妊娠早期母胎界面氧浓度变化对胎盘发育的影响,揭示在胎盘形成过程中HIF-1α与MMP-9的相互关系,为妊娠期高血压疾病的发病机制提供新的思路。研究方法:1.临床收集子痫前期患者胎盘组织30例(其中轻度12例,重度18例)及正常妊娠孕妇的胎盘组织20例,采用SP免疫组化法检测各组胎盘组织中HIF-1α及ET-1的蛋白表达部位及表达量;Western-blotting法检测各组胎盘组织中HIF-1α及ET-1蛋白表达量。2.采用组织贴块培养法对早孕期无菌绒毛组织进行原代培养。绒毛反复漂洗去除血块,眼科剪清除脱膜组织后,分离绒毛组织,剪碎;糊状组织碎片以间距5mm均匀铺于湿润的培养瓶底部,用适量含15%胎牛血清的DMEM培养基进行培养;隔日换液,2周后消化传代。利用消化培养法及差速贴壁法对滋养细胞进行分离纯化。角蛋白及其波形蛋白检测细胞纯度。3.利用化学缺氧诱导剂CoCl2诱导不同氧浓度环境,将体外分离培养的滋养细胞分为低氧组1(100μl/L 24h)、低氧组2(50μl/L 24h)、复氧组(50μl/L 6h ~18h)、常氧组(24h)进行培养,Trizol法分别收集各组细胞提取总RNA,运用半定量PCR技术检测各诱导组细胞中HIF-1α与MMP-9mRNA的表达量。研究结果:1.子痫前期组与正常组比较,HIF-1α表达明显增高,差异有显著性(t=-5.710,P<0.05),重度子痫前期HIF-1α的表达明显高于轻度子痫前期,差异具有统计学意义(t=-6.945,P<0.05)。同样,子痫前期组与正常组比较,ET-1表达明显增强,差异具有统计学意义(t=-3.659,P<0.05),重度子痫前期ET-1的表达明显高于轻度子痫前期,差异具有统计学意义(t=-7.966,P<0.05)。子痫前期组胎盘组织中HIF-1α和ET-1的相关性分析显示两者呈正相关(γ=0.659,P<0.05),随着缺氧程度的加深,绒毛组织中HIF-1α与MMP-9的表达量呈负相关性。2.组织块儿贴壁24小时后细胞开始向组织周边贴壁扩散生长,一周后细胞数量明显增多,多呈多边不规则形状或长梭形。两周后组织团块边界明显模糊与周边细胞融合,部分细胞团间连接平铺呈片状生长,三周铺满60%培养瓶底部。经多次反复贴壁法及消化排除法传代后,细胞多呈上皮细胞样片状平铺生长,多角不规则形态,形态基本一致,个别呈纤维样细胞。核大呈圆形,近于细胞中央,胞质丰富。经免疫组化化学染色,CK7阳性表达率呈75%以上,波形蛋白阳性表达率低于10%,说明滋养细胞的纯度在75%以上。3.低氧1组HIF-1αmRNA的表达最明显,随着CoCl2浓度的降低,细胞生长环境的氧浓度增高,HIF-1αmRNA的表达呈明显降低趋势);同时,MMP-9mRNA在常氧组的表达最明显,随着CoCl2浓度的增高,细胞生长环境的氧浓度降低,MMP-9mRNA的表达呈明显降低趋势,两者呈负性相关。结论:1. HIF-1α在患病组胎盘的表达明显高于正常妊娠孕妇组,并且与血管收缩性密切相关的ET-1呈正相关,HIF-1α的异常表达可以引起下游靶基因的异常转录,影响胎盘的发育。HIF-1的降解和转录与妊高症的产生具有相关性。2.妊娠期高血压疾病的发生很可能是由于HIF-1调节异常,影响了与滋养细胞侵入密切相关的MMP-9的表达,导致滋养细胞侵入能力降低,说明低氧应答过程MMP-9的降低可能与HIF-1的调控异常存在相关性,近而影响到妊娠早期胎盘植入过程。3.组织贴壁法原代培养滋养细胞虽然细胞纯度会受影响,但较容易生长,可利用成纤维细胞与上皮样细胞的贴壁时间差消化提纯,简单易行。