【摘 要】
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线粒体是真核细胞中非常重要的细胞器。线粒体分裂和融合的平衡,其在细胞内的分布与定位变化等对细胞稳态的维持起着至关重要的作用。然而,目前由于缺乏有效的精准调控手段,针对线粒体的形态变化、在细胞内的定位分布与其功能之间的关联性还不甚明了。本论文利用光遗传学工具实现了活细胞内线粒体聚集分布与定位的快速光学操控,结合活细胞显微成像技术研究了光操控过程中线粒体分布与定位的动态变化情况,并应用生化手段探究了瞬
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线粒体是真核细胞中非常重要的细胞器。线粒体分裂和融合的平衡,其在细胞内的分布与定位变化等对细胞稳态的维持起着至关重要的作用。然而,目前由于缺乏有效的精准调控手段,针对线粒体的形态变化、在细胞内的定位分布与其功能之间的关联性还不甚明了。本论文利用光遗传学工具实现了活细胞内线粒体聚集分布与定位的快速光学操控,结合活细胞显微成像技术研究了光操控过程中线粒体分布与定位的动态变化情况,并应用生化手段探究了瞬时与可逆性光学操控对细胞线粒体功能所造成的影响。本文的主要研究内容总结如下:1、光遗传学操控活细胞线粒体聚集分布的研究基于CRY2-CIBN系统的二聚化和CRY2high的低聚化作用,通过蓝光刺激光控蛋白元件Opto-Mito C（Tom20-CIBN-GFP、m Cherry-CRY2high）在COS-7细胞中实现光控线粒体的聚集分布,并进行实时显微成像及聚集程度的定量分析。研究表明:（1）Opto-Mito C能成功诱导细胞中线粒体的光控聚集;（2）建立图像熵值算法实现了对线粒体聚集程度的定量分析;（3）尽管光控蛋白元件OptoMito C具有可逆性,能在撤去蓝光刺激之后解聚,但其所引起的细胞线粒体的聚集分布是不可逆的。2、线粒体往细胞膜周快速运输定位的光操控研究利用包含驱动蛋白家族成员5A的质粒KIF5A-CIBN-GFP和定位于线粒体外膜的Miro1-m Cherry-CRY2光控蛋白元件,光控COS-7细胞的线粒体快速地向细胞膜周运输,并进行实时追踪成像及线粒体分布的定量分析。研究表明:（1）通过光照募集驱动蛋白至线粒体外膜可以实现线粒体向细胞膜周快速运输的光遗传学操控;（2）通过核周荧光面积与全细胞荧光面积比值的变化可以定量分析线粒体向细胞膜周运输的程度;（3）光控驱动蛋白诱导的线粒体膜周定位改变了线粒体形态结构,且不完全具有可逆性。3、光控线粒体聚集分布及向细胞膜的运输对线粒体功能的影响研究研究表明:（1）光控Opto-Mito C诱导的线粒体聚集可显著改善Niclosamide药物引起的线粒体功能异常,可上调细胞ATP水平,降低细胞中ROS含量及减少线粒体通透性转换孔的开放程度,并且此影响不具有光控的可逆性;（2）光控驱动蛋白诱导的线粒体向细胞膜的运输会造成COS-7细胞的ROS含量上调、ATP水平上升,在短期内此影响不具有可逆性。总之,本论文研究建立了活细胞内线粒体聚集分布及定位的光遗传学操控方法,结合图像定量处理分析技术与生化手段,探究了线粒体形态及分布的改变情况及其对细胞线粒体功能产生的影响。这些研究成果可加深对细胞线粒体生理机制的进一步了解,为今后开展线粒体定位与功能的研究提供了新的方法。
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