前言乳腺癌的发病率和死亡率逐年升高,是严重威胁女性身心健康的恶性肿瘤之一。而乳腺癌的复发和转移是影响其疗效的主要因素。因此,迫切需要寻找一个敏感性好且能较早预测乳腺癌转移的分子生物学标记物及能够抑制其增殖、迁移运动和转移的基因治疗靶点,为临床对乳腺癌的复发和转移做出早期预测提供一定的参考依据,从而有助于及时采取更加有效的治疗措施。人RACK1 (receptor of activated C-kinase 1)定位于人的第5号染色体(5q35.3),cDNA全长951 bp,其编码的蛋白质分子量为35kDa。有学者在人黑色素瘤、口腔鳞癌等肿瘤中对RACK1与肿瘤转移的关系进行了研究。但该基因与人乳腺癌增殖、迁移运动和侵袭转移的关系究竟如何,以及RACK1与乳腺癌生物学行为的相关性等问题,目前国内外尚未见系统性的研究报道,更无其促进人乳腺癌增殖、迁移运动和侵袭转移的分子机制的研究报道。本课题试图从人乳腺癌细胞株、裸鼠原位(乳垫下)移植瘤模型和人体乳腺癌组织三方面对RACK1表达与乳腺癌生物学行为的相关关系及其作用的分子机制进行研究,以寻找预测人乳腺癌转移的分子生物学标记物及分子治疗的新靶点。故该课题的研究不仅对了解肿瘤的生物学特性具有明显的理论意义,也具有显著的临床价值和社会效益。第一部分从人乳腺cDNA文库中筛选与PI3K plloa相互作用的候选分子及相互作用的验证目的筛选与PI3K p110α相互作用的新候选分子。方法采用酵母双杂交系统以pGBKT7-PIK3CA质粒为钓饵,在人乳腺cDNA文库中筛选。经酵母重新转化验证后,在哺乳动物细胞中使用免疫共沉淀(immunoprecipitation, IP)和免疫荧光(immunofluorescence, IF)共定位的方法确定候选分子RACK1和PI3Kplloα的相互作用。结果以pGBKT7-PIK3CA质粒为钓饵,在人乳腺cDNA文库中筛选出RACK1作为候选分子。在哺乳动物细胞中免疫共沉淀确定两者相互作用,免疫荧光确定两者共定位于胞质。小结成功构建pGBKT7-PIK3CA质粒并以此为钓饵质粒,利用酵母双杂交系统从人乳腺cDNA文库筛选出RACK1,在酵母和哺乳动物细胞中验证了候选分子RACK1与PI3K p110α存在相互作用,并确定其作为进一步研究的对象。第二部分RACK1对人乳腺癌增殖、迁移和侵袭转移的影响目的明确RACK1对人乳腺癌增殖、迁移和侵袭转移的影响。方法采用脂质体介导法将pEGFP-N3-RACK1转染人乳腺癌细胞MCF7和T-47D,以筛选出稳定高表达RACK1的细胞株。采用生长曲线和流式细胞技术研究RACK1对人乳腺癌细胞体外增殖的影响；使用划痕实验和transwell迁移实验研究RACK1对其体外迁移运动能力的影响；应用transwell侵袭实验研究RACK1对人乳腺癌细胞体外侵袭运动能力的影响；同时建立裸鼠原位移植瘤模型,从体内角度研究高表达RACK1对乳腺癌增殖、侵袭转移的影响。结果获得稳定高表达RACK1的MCF7和T-47D细胞株；体外实验表明,与对照组相比,稳定高表达组的细胞倍增时间明显降低,S期的比例明显增高；体外迁移运动和侵袭能力明显提高。在裸鼠移植瘤实验中发现,稳定高表达RACK1细胞组裸鼠乳垫下移植瘤生长较对照组明显加快,肿瘤的体积和重量明显增加,侵袭性明显提高。小结采用脂质体介导法将pEGFP-N3-RACK1成功转染人乳腺癌细胞MCF7和T-47D,获得稳定高表达RACK1的细胞株。高表达RACK1在体内、外均能促进人乳腺癌增殖、迁移运动和侵袭转移潜能。第三部分RACK1对人乳腺癌增殖、迁移和侵袭转移影响的相关机制研究目的阐明RACK1对人乳腺癌增殖、迁移运动和侵袭转移作用的机制。方法采用Western blot的方法检测稳定高表达RACK1的人乳腺癌细胞和相应抑制剂处理后以及RACK1 siRNA干扰人乳腺癌细胞后,细胞周期相关蛋白表达的变化,及PI3K/Akt和MAPK信号通路中关键分子活性的改变；采用IP和IF检测RACK1和RhoA在细胞中的相互作用；采用细胞体外迁移实验检测Rho激酶抑制剂处理后稳定高表达RACK1的人乳腺癌细胞体外迁移能力的改变；采用GTP-Rho pull-down实验检测稳定高表达RACK1的细胞和Rho激酶抑制剂处理后以及RACK1 siRNA干扰后RhoA活性的改变；采用明胶酶谱实验检测稳定高表达RACK1的人乳腺癌细胞和RACK1 siRNA干扰后细胞MMPs活性的改变;采用免疫组织化学(immnohistochemistry, IHC)的方法在体内研究RACK1促进人乳腺癌增殖、侵袭转移能力的体内机制。结果与空载对照组相比,稳定高表达RACK1的人乳腺癌细胞株p-Akt的表达明显上升,细胞周期素cyclin D1和cyclin D3的表达也明显上升,而p21的表达下降。使用PI3K的抑制剂(LY294002,10μM)12、24h后,cyclin D1和cyclin D3的上调被抑制,而p21的表达上升；IP证实RhoA与RACK1存在相互作用,IF显示两者共定位于MCF7和MCF7/ADR的胞质；与溶剂对照组相比,使用Rho激酶的抑制剂Y-27632(10μM)预处理的稳定高表达细胞,其迁移能力明显被抑制；Rho活性检测实验显示与空载对照组相比,稳定高表达细胞中活化的RhoA显著增多,而在使用了RACK1 siRNA或Y-27632后又明显减少；Western blot和明胶酶谱检测结果显示,与对照相比,稳定高表达RACK1的细胞株CD147的表达和MMP2的活性明显上升；裸鼠IHC结果显示,与空白亲本及空载对照组相比,稳定高表达组裸鼠组织中Ki67和MMP2的表达明显上升。小结RACK1通过调节PIK/Akt信号通路的活性及细胞周期相关蛋白p21的下调、cyclin D1和cyclin D3的升高,参与调控人乳腺癌细胞的增殖能力；RACK1通过与RhoA的相互作用及活化RhoA/Rho激酶通路,促进人乳腺癌细胞的迁移运动；RACK1通过调节CD147的表达及MMP2的活性,促进人乳腺癌的侵袭转移能力。第四部分人乳腺癌组织中RACK1的表达及其与临床参数的关系目的阐明人乳腺癌组织中RACK1的表达及其与临床参数的关系。方法采用IHC的方法在160例人乳腺癌组织标本中研究RACK1的表达及其与临床参数的关系。结果RACK1蛋白主要表达在细胞质中；在160例乳腺癌标本中,40例样本表现为癌细胞RACK1表达评分为2级,有54例评分为1级,有66例评分为O级；RACK1的表达与肿瘤大小(P=0.046)、淋巴结转移(P=0.027)、临床分期(P=0.007)和组织学分级(P=0.004)相关；RACK1的表达与Ki67有很强的相关性,经Pearson’s相关分析,两者的相关系数高达0.930,P<0.001；另外,RACK1与RhoA、HER-2呈正相关；与原位癌百分比、ER, PR呈负相关；Kaplan-Meier生存分析揭示,RACK1的高表达与乳腺癌癌患者较短的生存期之间有显著相关性(P<0.001)；单、多因素生存分析显示RACK1蛋白在乳腺癌患者预后分析中是一个独立的有预后意义的分子指标(P=0.006); RACK1的ROC曲线下的面积为0.833,而其它临床肿瘤分子指标的ROC面积均低于0.80,分别为Ki670.766,ER 0.446,PR0.387和HER-20.689。小结RACK1在乳腺癌患者预后分析中是一个独立的有意义的分子指标；与其他乳腺癌临床常用分子指标相比,RACK1具有更大的优越性和更广阔的应用前景。