胃癌和肝癌是我国最常见的恶性肿瘤,在消化系统肿瘤中死亡率排名第二、第一。顺铂治疗是进展期胃癌患者的一线化疗药物之一;TACE/索拉菲尼是中晚期肝癌患者的主要治疗手段;然而,肿瘤的异质性导致二者在治疗过程中易产生药物耐受,治疗效果并不尽人意,患者获益时间短。葡萄糖调节蛋白75（GRP75）是热休克蛋白70家族成员。研究表明,GRP75在诸多肿瘤中高表达,且与肿瘤耐药及预后不良密切相关,其机制可能与p53抑制有关,然而我国胃癌和肝癌p53突变率较高。提示:GRP75参与诱导/维持胃癌和肝癌耐药的过程中存在p53非依赖方式,然而具体机制却鲜见报道,仍有待进一步研究。生理条件下,内源性27-羟基胆固醇（27HC）富集于肝脏并被代谢和排出体外;而在肿瘤病理条件下,肝脏代谢功能紊乱,导致肝癌组织局部高浓度27HC暴露,为保护细胞免受27HC毒性,部分肝癌细胞建立了特殊的羟固醇代谢体系。提示:肝癌进程中27HC长期暴露在诱导细胞产生适应机制的同时,其功能角色亦发生了从肝癌细胞毒性到促癌作用的转变。因此,深入研究胃癌和肝癌耐药的潜在机制,探索精准方式干预逆转抵抗,可以有效提升总体疗效,改善患者生存时间。本研究旨在探讨GRP75诱导/维持胃癌和肝癌耐药的作用/机制及其临床意义。方法一、构建胃癌顺铂耐药和27HC长期暴露诱导肝癌多药耐药的模型胃癌顺铂耐药细胞株SGC7901^CR购自凯基生物技术有限公司。细胞培养于含1μg/mL顺铂的RPMI-1640培养液中以维持顺铂耐药表型。常规培养Bel-7402细胞24 h后,用含1.25μM 27HC的RPMI 1640培养液培养Bel-7402细胞48-72 h,再用含2.5μM 27HC的培养液并培养1周,待细胞适应后,27HC浓度再次增加至5μM并培养1周,最终以10μM 27HC进行大剂量冲击的严格筛选,如此逐步暴露于浓度递增的27HC中培养50代（约5月）后使细胞能在含2.5μM 27HC的培养液中持续稳定生长,成功建立Bel^27HC细胞株;对照培养Bel-7402细胞记为Bel ^PC。二、定量PCR（qPCR）细胞总RNA提取和浓度测定、cDNA逆转录、引物扩增后加入qPCR-mix试剂,在定量PCR仪上检测并利用2^{-（ΔΔCt）}法评估基因扩增效率及变化比率。三、Western blot细胞总蛋白提取和浓度测定,电泳分离蛋白,转膜后封闭,再加入一抗4℃摇床孵育过夜,次日与二抗常温下结合1-2 h,通过加入增强型发光液发光成像并分析灰度以检测表达水平。四、细胞活力检测和IC₅₀计算通过不同浓度顺铂或27HC处理24 h后的细胞重新加入培养液和CCK-8溶液,孵育4h,用酶标仪450 nm滤光片测定吸光度值。通过计算顺铂或27HC处理组与对照组的吸光度比值得到相对活力及graph-pad生成抑制曲线和IC₅₀值。五、生物信息学分析从GEO数据库下载微阵列数据集,用R语言程序包鉴定并筛选耐药细胞系/组织与亲本细胞系/组织的表达有显著差异的基因（DEG）,基于DAVID数据库,分析DEG的功能和生物学特性。通过STRING数据库构建60种蛋白质与GRP75显著相关的互作网络,再基于KEGG数据库和R语言的在线工具Network Analyst分析蛋白互作网络的富集信号通路。六、线粒体膜电位（MMP）检测转染后细胞分别给予不同浓度顺铂或27HC处理24 h;再换新鲜培养液并加入JC-1染色工作液,培养箱中孵育20 min;在多孔板读数器上检测JC-1单体和JC-1聚合物荧光强度。七、细胞内活性氧（ROS）及超氧化物、过氧化氢检测待检测细胞分别给予不同浓度的顺铂或27HC处理不同时间;吸除培养液后加入适量DCFH-DA,培养箱中孵育20 min;通过荧光显微镜观察荧光信号,在多孔板读数器Ex（λ）488 nm和Em（λ）525 nm处读取DCFH荧光强度。Bel-7402细胞吸除培养液并加入超氧化物检测工作液,培养箱中孵育3 min,给予27HC处理不同时间;在酶标仪450 nm波长处测定吸光度值。27HC处理不同时间的Bel-7402细胞收集、离心后弃上清,加入过氧化氢检测裂解液充分混匀,4℃12000g离心5 min,收取上清样品;在检测孔内加入细胞样品和过氧化氢检测试剂,轻轻混匀,室温下静置30 min;立即测定A₅₆₀并根据标准曲线计算出样品中过氧化氢的浓度。八、细胞凋亡检测转染后细胞分别给予不同浓度顺铂或27HC处理48 h;收集培养液和贴壁细胞,离心后弃上清,重悬于FITC-Annexin V和PI混合液中,室温避光孵育20min后使用流式细胞仪检测。九、葡萄糖摄取检测转染后细胞加入无葡萄糖或碳源培养液培养,分别给予不同浓度顺铂或27HC处理6 h;吸除培养液,加入适量荧光葡萄糖2-NBDG,培养箱中孵育30min,在多孔板读数器Ex（λ）465 nm和Em（λ）540 nm处检测荧光强度。十、细胞生长检测将转染后细胞在有或没有顺铂/27HC处理的情况下置于细胞培养箱中培养24 h,收集细胞并在显微镜下使用细胞计数器计数。十一、裸鼠移植瘤实验将SGC7901^CR细胞按2×10⁷个细胞/mL注射于裸鼠腹侧,待肿瘤长至合适大小后进行分组干预:（1）对照组,（2）GRP75敲除组,（3）对照+顺铂治疗组,（4）GRP75敲除联合顺铂治疗组;每周测量肿瘤体积,5周后取出肿瘤组织并进行组织病理学检测及组织PCR。十二、免疫组织化学（IHC）检测制备组织切片后将切片在10%的正常牛血清白蛋白中孵育5 min,一抗4℃孵育过夜;二抗室温下孵育30 min;样品进行可视化、脱水、清除、固定等处理后,Panoramic-scan数字切片扫描系统上照相;Image-Pro-Plus 6.0软件分析图形。十三、统计分析实验数据用均数±标准差表示,统计结果的显著性是通过graph-pad 8.0软件计算得来,Kaplan-Meier生存曲线和对数秩检验用于总体生存分析,卡方检验用于临床病理特征分析,Cox回归模型用于与整体生存相关的独立预后因素分析。p<0.05具有统计学意义。结果一、GRP75在胃癌顺铂耐药和肝癌多药耐药中的作用胃癌顺铂耐药细胞(SGC7901^CR)和肝癌多药耐药细胞(Bel^27HC、Bel^5-Fu、Hu H7^SR)中GRP75的表达水平明显高于其亲本细胞。用不同浓度顺铂或27HC处理SGC7901^CR或Bel^27HC及其亲本细胞24 h后,发现耐药细胞的化疗药物IC₅₀显著升高;在SGC7901^CR或Bel^27HC细胞中敲除GRP75,结果发现GRP75敲除组较对照组的化疗药物IC₅₀显著抑制;相反地,在SGC7901或Bel-7402细胞中过表达GRP75,GRP75过表达组的IC₅₀（μM）显著升高。二、GRP75诱导胃癌顺铂耐药和肝癌多药耐药的潜在机制通过DAVID数据库对GSE122130(SGC7901^CR vs.SGC7901)、GSE14209（顺铂耐药组织vs.顺铂敏感组织）、GSE129071(MHCC97L^L-OHPvs.MHCC97L)、GSE73571（sorafenib耐药干细胞集落vs.亲本干细胞集落）的DEG进行KEGG-pathway和GO-term分析,结果提示氧化还原、凋亡、对药物/缺氧的应答、代谢通路及PI3K/AKT信号通路是导致其耐药差异的关键过程或通路。通过Network Analyst对以GRP75为核心的PPI网络进行KEGG-pathway分析,结果发现代谢通路在GRP75及其相互作用蛋白的PPI网络中亦有举足轻重的作用。三、GRP75调控抗氧化/凋亡在胃癌顺铂耐药和27HC诱导的肝癌多药耐药中的作用及机制相较于亲本细胞,SGC7901^CR和Bel^27HC细胞内ROS水平升高;在SGC7901^CR或Bel^27HC细胞中敲除GRP75破坏了MMP的稳定,抑制NRF2及其下游抗氧化调控因子HO1、NQO1的表达,并进一步增强顺铂或27HC诱导的ROS水平和细胞凋亡;在SGC7901或Bel-7402细胞中过表达GRP75则具有相反的作用。四、GRP75调控代谢重编程在胃癌顺铂耐药和27HC诱导的肝癌多药耐药中的作用及机制相较于亲本细胞,SGC7901^CR和Bel^27HC细胞内的p-AKT、HIF1α和c-myc蛋白表达水平升高;在SGC7901^CR或Bel^27HC细胞中敲除GRP75抑制p-AKT、HIF1α、c-myc及其下游糖酵解关键酶HK2、PDK1、LDHA的表达水平,进一步抑制顺铂或27HC诱导的葡萄糖摄取、细胞活力和生长;反之,在SGC7901或Bel-7402细胞中过表达GRP75则表现出反作用。五、裸鼠移植瘤模型验证胃癌顺铂耐药的体外实验结果实验结果表明:敲除GRP75结合顺铂治疗较单独顺铂治疗或单独敲除GRP75,显著抑制了肿瘤生长;与单独顺铂治疗相比,敲除GRP75结合顺铂治疗明显抑制了Ki-67、GRP75、NRF2、p-AKT及其下游靶基因的表达,显著刺激了细胞凋亡。六、27HC调控肝癌中GRP75的潜在机制用27HC处理Bel-7402 48 h结果发现,胞内ROS、超氧化物和过氧化氢的水平均呈现出先升后降的趋势,且在终末时间点的水平均显著高于起始时间点;进一步用超氧化物歧化酶抑制剂处理Bel-7402细胞发现,GRP75 mRNA和蛋白表达水平较对照组均显著升高。提示:27HC处理可诱导胞内氧化应激信号水平增加,从而诱导GRP75的应激性升高,进而抵抗“压力”并发挥作用。七、GRP75作为促癌因子的鉴定及其临床意义TCGA数据库中肝癌患者和胃癌临床患者的癌组织中GRP75表达水平显著高于癌旁组织。胃癌临床样本中GRP75表达水平随着TNM分期的进展而升高,GRP75表达水平与肿瘤横向直径呈正相关;我们收集的胃癌样本及数据库中的胃癌样本的总体生存期曲线结果都提示,高水平的GRP75与预后不良密切相关;临床病理特征统计检验及多因素分析表明,GRP75不仅仅与临床病理侵略特性有关,亦是总体生存期的独立预后因素。结论1.GRP75通过调控抗氧化/凋亡和代谢重编程促进胃癌和肝癌细胞的存活/生长,进而参与胃癌顺铂耐药和27HC诱导的肝癌多药耐药。2.GRP75在胃癌和肝癌组织或耐药细胞中高表达且与胃癌预后不良有关。3.GRP75可能是逆转胃癌顺铂耐药的潜在治疗靶点,亦可能成为指导胃癌临床治疗和预测不良预后的生物标记。4.GRP75不仅是肝癌中27HC的角色由细胞毒性转变为促癌作用的关键调控分子,亦是逆转27HC长期暴露诱导肝癌多药耐药的潜在治疗靶点。