Toll样受体(toll like receptors，TLRs)作为一种重要的模式识别受体，主要表达于巨噬细胞和树突状细胞表面，构成机体免疫反应第一道防线。Toll蛋白最早发现在调控果蝇的胚胎发育过程起重要作用，后继的研究表明Toll蛋白能激发果蝇抗微生物感染，特别是抗真菌感染免疫应答，构成果蝇的天然免疫系统。Toll在各种生物体內高度保守，近年来，相继发现并克隆了11种TLR分子，选择性识别病原体中特定的分子结构，如TLR2、TLR4、TLR5、TLR7或TLR9分别识别病原微生物的LTA、LPS、flagellin、dsRNA或CpG基序，以抵抗病原菌的入侵。TLRs不仅启动天然免疫应答，同样也调节获得性免疫应答的程度和类型；TLR家族成员的缺失导致机体对病原体高度易感。因此TLRs的功能及其作用信号转导机制的研究具有重要的理论意义和应用价值，成为近年免疫学领域的一大研究热点。本研究课题探讨了TLR9活化巨噬细胞新的信号转导机制。 CpG基序是存在于细菌DNA中具有强烈免疫刺激活性的特定序列。CpG基序在细菌DNA中以一定的频率随机存在；而在脊椎动物DNA中出现的频率相对较低，甲基化程度高，且含有较多的抑制性序列。这种差异使得脊椎动物可通过识别CpG基序区分自我和非我，激发针对病原微生物的免疫反应。人工合成的以非甲基化胞嘧啶—鸟嘌呤二核苷酸为核心的特定六核苷酸序列，即CpG寡核苷酸(CpGOligodeoxynucleotides，CpG ODN)，能模拟细菌DNA的免疫活性效应。CpG ODN可活化多种免疫细胞(包括B细胞、巨噬细胞和树突状细胞)产生多种细胞因子和趋化因子，尤其分泌较多的IFN-γ、IL-12和L-18等Th1型细胞因子，使免疫应答向Th1型免疫应答转换。因此CpG ODN在疫苗佐剂的研制、哮喘等Tb2型变态反应性疾病和系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的防治方面有广阔的应用前景。 当前对CpG ODN活化免疫细胞分子机制的研究倍受瞩目。文献报道TLR9识别第二军医大学博士研究生学位论文细菌DNA中非甲基化的CpG基序，为CpG基序活化免疫细胞所必需。CpG ODN通过TLRg依次活化MyD88/I RA玲TRAF6激酶链，最终激活MAPK和NF一KB并调节免疫相关基因的表达。小GTP结合蛋白一Ras介导多种细胞因子和生长因子对MAPK信号途径的活化。对于RaS蛋白是否参与CpG ODN信号转导过程，目前未见文献报道。 本研究发现，RaS特异性抑制剂一FTI一277，可剂量依赖性地抑制CpG ODN诱导的巨噬细胞R人W264.7产生一氧化氮和TNF一a。野生型Ras蛋白过度表达促进CpGODN活化的一氧化氮和TNF一a分泌;转染功能缺陷型Ras质拉(RasN17)则能抑制一氧化氮和TNF一a的产生。由于NO和细胞因子是巨噬细胞活化后发挥效应作用的重要介质分子，因此Ras蛋白为CpG ODN诱导巨噬细胞充分活化所必需。 Ras蛋白高表达还能增强CpG ODN诱导的MAPKs包括ERK和JNK信号分子的磷酸化，高表达RasN17则抑制ERKI/2和州KI/2的磷酸化。同时Ras或RasN17高表达对CpG ODN诱导的p38活化影响不大。利用NF一虑报告基因检刚系统，我们发现野生型Ras质粒转染的RAw264.7细胞后，CpG ODN诱导的NF一KB转录活性明显强于对照质粒转染组，且增强效应与野生型Ras质粒的转染剂量呈正相关。此外，免疫沉淀的结果证实RaS蛋白过度表达增强TLRg信号途径中起关健作用的IRAKI/T RAF6复合物的形成，功能缺陷型RasN17则抑制CpG激发的上述反应。因此在CpG ODN活化TLRg信号通路中，Ras分子位于MAPK和NF一KB分子活化的上游。 CpG ODN时间和剂量依赖性地快速诱导小G蛋白Ras活化，CpG ODN刺激巨噬细胞后2分钟即可检测到Ras的活化，5分钟时活化最强，以后逐渐减弱。我们用免疫沉淀实验发现CpG ODN还能诱导Ras与TLRg的结合。同样条件下non一CpG既不能活化Ras，也不能诱导Ras/T LRg复合物的形成，提示Ras活化以及Ras与TLRg的结合具有CpG基序特异性。令人感兴趣的是，从时间上看Ras的活化早于Ras与TLRg复合物的形成，考虑到CpG ODN发挥作用依赖内吞过程及内质体的成熟，我HOngmeiXu，DePt.of加m“nolo邵乙SeeondMill’tary五介dieaIUniversi尔ShanghaiZO0433第二军医大学博士研究生学位论文们推测CpG ODN有可能通过活化Ras，促进TLRg与Ras的结合并进入内质体，进而激活下游的信号分子，最终活化MAPK和NF一虑，调节相应基因的表达。 总之，本研究发现CpG ODN作用巨噬细胞后，可迅速活化Ras蛋白分子并诱导Ras和TLRg的结合。Ras不仅介导CPG ODN诱导的MApK和NF一KB分子的活化，也调节IRAKI/T RAF6复合物的形成。这一发现从理论上丰富了CpG ODN活化免疫细胞的分子调控机制，为免疫性疾病的治疗提供了新的靶点，同时对TLR家族其它成员信号机制的研究也具有一定的借鉴意义。