研究背景子痫前期(preeclampsia,PE)是妊娠期特发的严重并发症,以妊娠20周以后发生的高血压、蛋白尿、心肝肾等多脏器功能障碍为主要临床表现,并可引起胎儿生长受限、胎死宫内等不良结局,是目前孕产妇和围产儿致病率和病死率的重要原因,严重威胁母婴健康。多数患者在妊娠终止后病情逐步缓解,但仍有一部分患者会出现不可逆的肝肾等多器官功能损害。根据发病的孕周,重度PE可分为早发型(<34周)和晚发型(≥34周)。早发型重度PE的病情更重,进展更快,更易发生脏器功能损害,心脑血管意外、胎盘早剥、胎死宫内等不良结局的发生率更高,临床上治疗最为棘手。PE发病的核心为子宫螺旋动脉重塑异常与全身血管内皮系统损伤,但发病机制尚不完全明确,因此,阐明妊娠早期滋养层细胞的损伤机制对于明确PE发病机制、寻找临床治疗的药物靶点具有非常重要的意义。炎症免疫过度激活是PE的发病的重要机制之一。研究发现,重度PE患者的母胎界面及全身内皮系统的炎症反应过度激活,TNF-α、IL-6及IL-1βmRNA的表达均显著升高。目前,炎症因子过度激活的分子机制尚不明确,任何导致炎症因子表达增加的因素均可能会参与PE的发病过程。sFlt-1是重要的抗血管生成因子,可竞争性结合VEGF和PIGF,激活氧化应激,导致全身血管内皮损伤及血压升高,诱导PE发病。缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor-1α,HIF1α)是重要的转录因子,可负性调节VEGF的表达,抑制血管生成。在重度PE患者的胎盘组织中,sFlt-1与HIF1α的表达显著增加。因此,sFlt-1与HIF1α是参与PE发病的重要因子。亲环素A(CyclophilinA,CypA)是体内重要的炎症因子,是亲环素蛋白家族中分布最广泛、表达最丰富的一员。CypA有细胞内和细胞外两种存在形式,细胞内CypA(intracellular CypA,iCypA)参与蛋白质的折叠、转运与功能,而在缺氧、感染、氧化应激等疾病状态下,iCypA可分泌到细胞外(extracellular CypA,eCypA),介导细胞间的通讯与信息传导,参与细胞的凋亡、侵袭与迁移和氧化应激反应等。已证实,eCypA介导心血管系统多种疾病的发生发展,如动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、肺动脉高压等。PE与心血管疾病在发病的高危因素及病理改变上有着诸多的共同点,因此,eCypA可能也参与了重度PE的发病过程。CypA 的编码基因为 PPIA(peptidylprolyl isomerase A),位于 7p13 染色体区域,包含多个基因型。研究表明,CypA基因多态性与冠状动脉疾病的发病及疾病的严重程度密切相关。目前,尚未有CypA基因多态性及其表达与重度PE相关性的研究报道。本研究即对CypA基因多态性与重度PE的相关性进行探讨,并通过检测外周血及胎盘组织中CypA的表达分析其与重度PE发病的关系,进一步通过体外细胞学实验探讨eCypA对JEG3滋养细胞炎性因子的表达、凋亡及sFlt-1与HIF1α表达的影响,寻找其中可能的分子机制,为重度PE的发病机制和临床治疗提供实验依据。第一部分Cyclophilin A基因多态性与重度子痫前期相关性的研究研究目的探讨 Cyclophilin A 基因 SNP rs3735481,rs9638978 和 rs11984372 的多态性与重度子痫前期的相关性。研究方法选择2015年7月至2017年9月在山东大学第二医院产科分娩的261例孕妇为研究对象,依据病情分为重度子痫前期组(preeclampsia group,PE组)82例,正常妊娠组(control group,对照组)179例。将PE组进一步分为早发型重度 PE(early-onset PE group,e-PE 组,n=38)和晚发型重度 PE(late-onset PE group,1-PE组,n=44)两组。于分娩前抽取其空腹静脉血,提取单核细胞DNA。通过Haploview软件分析CyclophilinA(CypA)编码基因PPIA所在区域连锁不平衡状况,选择 SNP 位点 rs3735481,rs9638978 和 rs11984372。利用 TaqMan 探针法对外周血DNA进行等位基因分型测定。分析三个SNP位点等位基因频率及基因型在共显性、显性、隐性及过显性遗传模型下与重度PE的相关性,进一步探讨其与e-PE和1-PE的相关性。结果1.rs3735481基因分型测定显示,PE组与对照组中均存在AA、AC和CC三种基因型,等位基因A与AA基因型占优势,等位基因C与CC基因型最少。两组相比,PE组等位基因C的频率(14.6%)显著低于对照组(22.3%)(OR:0.6,95%CI:0.36-0.98,P<0.05),而等位基因型频率的差异无统计学应意义(P>0.05)。2.rs9638978基因分型测定显示,PE组和对照组均存在AA、AG和GG三种基因型,PE组等位基因A的频率(37.20%)显著高于对照组(27.65%)(OR:1.55,95%CI:1.05-2.29,P<0.05),而基因型频率的差异无统计学意义(P>0.05)。3.rs1 1984372基因分型测定显示,PE组和对照组均只存在AA、AC两种等位基因型,CC基因型均未检出,两组中等位基因A和AA基因型均占显著优势(92.68%vs.94.41%,96.34%vs.97.21%),等位基因与基因型的频率差异均无统计学意义(P>0.05)。4.四种遗传模型下分析显示,rs3735481与rs9638978基因型频率的差异均无统计学意义(P>0.05)。rs1 1984372因缺少CC基因型,仅作共显性分析,无显著性差异(P>0.05)。5.进一步分组显示:与对照组相比,e-PE组rs9638978等位基因A的频率显著高于对照组(P=0.002),Codominant模型AA vs.GG具有显著性差异(OR:5.75,95%CI:2.01-16.48,P<0.001),Dominant 模型(AA+AG)vs.GG 具有显著性差异(OR:2.29,95%CI:1.09-4.82,P<0.05),Recessive 模型 AA vs.(GG+AG)具有显著性差异(OR:4.32,95%CI:1.67-11.17,P<0.01);而 1-PE组与对照组相比,rs9638978等位基因频率及四种遗传模型下的基因型频率的差异均无统计学意义(P>0.05)。结论1.Cyclophilin A rs3735481和rs9638978的多态性与重度PE的发病相关。2.rs3735481等位基因C可能对重度PE的发病起保护作用;rs9638978等位基因A可能与重度PE的发病风险升高有关。3.rs9638978的等位基因A与AA基因型与早发型重度PE的发病相关。提示,CypA rs9638978 A/G多态性可能是早发型重度PE发病的易感基因。第二部分外周血与胎盘组织Cyclophilin A的表达与重度子痫前期相关性的研究研究目的探讨妊娠女性的外周血和胎盘组织中Cyclophilin A(CypA)的表达水平与重度PE的关系,及CypA基因多态性表达差异对重度PE发病的影响。研究方法根据年龄匹配原则在第一部分研究对象中选取本部分研究对象,分为PE组和对照组,PE组进一步分为e-PE组和l-PE组。于分娩前留取其空腹静脉血,胎盘娩出后5min内留取胎盘组织。利用ELISA法检测外周血CypA的表达水平,qRT-PCR法检测胎盘组织CypA mRNA的表达,Western blotting法、免疫组化及免疫荧光方法检测胎盘组织CypA的蛋白表达。结果1.ELISA检测显示,PE组患者外周血CypA的表达水平显著高于对照组(P=0.0003),进一步分组显示,e-PE组与l-PE组患者外周血CypA表达水平均显著升高(P<0.01),其中e-PE组的表达水平最高,但与1-PE组相比,无统计学差异(P>0.05)。2.Pearson相关性分析显示,外周血CypA表达水平与孕妇收缩压(r=0.37)及舒张压(r=0.24)均呈正相关(P<0.05)。3.ELISA检测显示,rs3735481 AC基因型孕妇的外周血CypA表达水平显著低于AA基因型(P=0.0185);rs9638978 AA基因型孕妇的外周血CypA表达水平显著高于AG和GG基因型(P<0.05),而AG和GG基因型孕妇的外周血CypA的表达差异无统计学意义(P>0.05);rs11984372 AA和AC基因型孕妇外周血CypA的表达水平亦无显著性差异(P>0.05)。4.qRT-PCR检测显示,PE组患者胎盘组织CypA mRNA的表达水平显著高于对照组(P<0.05),且e-PE组和1-PE组胎盘组织CypA mRNA的表达水平均显著升高(P<0.05),其中,e-PE组胎盘组织CypA mRNA的表达水平最高。5.Western blotting检测显示,PE组胎盘组织中CypA蛋白的表达水平显著高于对照组(P<0.05)。免疫荧光与免疫组化显示,PE组胎盘组织中CypA蛋白的表达显著升高,且主要定位于细胞外间质中,正常胎盘组织中亦有少量表达。结论1.重度PE尤其是早发型重度PE患者外周血CypA的表达水平显著升高,且其表达水平与孕妇的收缩压和舒张压水平呈正相关。提示,外周血CypA的高表达与重度PE的发病密切相关,CypA表达水平可反应病情的严重程度,或可成为重度PE的预测与病情评价的重要血清标志物。2.重度PE患者胎盘组织中CypA的表达水平显著升高,提示胎盘组织中CypA的表达升高与重度PE的发病密切相关。3.外周血CypA的差异表达与其基因多态性密切相关。rs3735481等位基因C与CypA的低表达有关,可能对重度PE的发病有保护作用;rs9638978等位基因A与CypA的高表达有关,可能参与了重度PE的发病。第三部分细胞外Cyclophilin A参与子痫前期发病的机制探讨研究目的探讨细胞外Cyclophilin A对JEG3细胞炎性相关因子的释放及凋亡的影响,及对sFLT1表达的影响,进一步沉默HIF1α,检测eCypA对HIF1α信号通路的影响,探讨eCypA参与PE发病的可能机制。研究方法体外培养JEG3滋养细胞系,利用外源性人重组CypA(hrCypA)蛋白模拟eCypA干预细胞,通过qRT-PCR法检测相关炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA的表达变化,流式细胞法及TUNAL法检测细胞的凋亡,western blotting法检测 p65、p-p65、IκBα、p-IκBα、caspase3、cleaved-caspase 3、parp1、cleaved parp1、P53、FLT1、HIF1α的表达,ELISA法检测细胞sFlt-1、IL-1β的分泌水平;并利用慢病毒载体介导的小干扰siRNA技术沉默HIF1α基因的表达,进一步检测IL-1β、p65、p-p65、Flt-1、sFlt-1表达及细胞凋亡的变化。结果1.qRT-PCR 显示,hrCypA 干预 JEG3 细胞后,TNF-α、IL-6、IL-1β 的 mRNA 表达水平显著升高(P<0.05),且随hrCypA浓度增加,mRNA表达水平呈升高趋势;Westernblotting显示:p-p65、p-IκBα的表达水平显著升高(P<0.05),且表达水平随hrCypA浓度增加而升高。2.流式细胞学和TUNEL法检测显示,hyCypA干预JEG3细胞后,细胞的凋亡明显增加(P<0.05),且随hrCypA浓度增加,细胞凋亡呈增加趋势;Western bloting显示:cleaved caspase 3、cleaved parp1 的表达水平显著升高(P<0.05),而 P53表达水平升高不明显(P>0.05)。3.qRT-PCR显示,hyCypA干预JEG3细胞后,FLT1的mRNA表达水平显著升高(P<0.05),且表达水平随CypA浓度增加而升高;Western blotting示:FLT1蛋白的表达显著升高(P<0.05);ELISA显示:分泌型sFlt1的表达显著升高(P<0.05),且表达水平随hrCypA浓度增加而升高。4.Western blotting显示,hyCypA干预JEG3细胞后,Hif1α的表达显著升高(P<0.05)。qRT-PCR显示:慢病毒载体介导Hif1αsiRNA转染JEG3细胞后,Hif1αmRNA的表达显著降低(P<0.05),转染效果好。5.hrCypA 干预 Hif1α siRNA 转染的 JEG3 细胞后,Western blotting 显示,与 NC组相比,CypA/NC组FLT1和p-p65蛋白的表达显著升高(P<0.05),而CypA/siHiflα组FLT1、p-p65蛋白的表达受到明显抑制(P<0.05);ELISA显示,与NC组相比,CypA/NC组sFLT1和IL-1β的表达水平显著升高,而CypA/siHif1α组sFLT1和IL-1β的表达受到显著抑制(P<0.05);TUNEL法检测示:与NC组相比,CypA/NC组细胞的凋亡显著增加(棕色为染色阳性细胞,即凋亡细胞),而siHif1α组细胞的凋亡较CypA/NC组明显减少,且凋亡细胞的着色程度明显减轻。结论1.细胞外CypA对滋养细胞具有促炎作用。2.细胞外CypA通过caspase 3途径促进滋养细胞凋亡。3.细胞外CypA可促进滋养细胞sFLT1的分泌。4.细胞外CypA可激活Hif1α信号通路,而沉默Hif1α可显著抑制其诱导的儿-1β、p-p65、sFLT1的表达及细胞的凋亡。提示,细胞外CypA可通过Hif1α信号通路调控其对滋养细胞的促炎、促凋亡及促sFLT1分泌功能。